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凝胶电泳 编辑

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凝胶电泳

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凝胶电泳是一种根据分子的大小和电荷对大分子(DNA、RNA和蛋白质)及其片段进行分离和分析的方法。它在临床化学中用于按电荷或大小分离蛋白质(IEF琼脂糖,基本上与大小无关),在生物化学和分子生物学中用于按长度分离DNA和RNA片段的混合群体,以估计DNA和RNA片段的大小或通过电荷分离蛋白质。

通过施加电场使带负电荷的分子穿过琼脂糖或其他物质的基质,从而分离核酸分子。较短的分子比较长的分子移动更快并且迁移得更远,因为较短的分子更容易通过凝胶的孔迁移。这种现象称为筛分。琼脂糖中的电荷将蛋白质分开,因为凝胶的孔太小,无法筛分蛋白质。凝胶电泳也可用于分离纳米颗粒。

凝胶电泳

凝胶电泳在电泳过程中将凝胶用作反对流介质或筛分介质,即带电粒子在电流中的移动。凝胶抑制了施加电场引起的热对流,还可以充当筛分介质,阻止分子通过。凝胶也可以简单地用于维持最终分离,从而可以应用电泳后染色。DNA凝胶电泳通常用于分析目的,通常是在通过聚合酶链反应(PCR)扩增DNA后进行的,但在使用其他方法(如质谱法、RFLP、PCR、克隆)之前,可以用作制备技术,DNA测序或Southern印迹进一步鉴定。

凝胶类型

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最通常使用的凝胶类型是琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。每种类型的凝胶都非常适合不同类型和大小的分析物。聚丙烯酰胺凝胶通常用于蛋白质,对小片段DNA(5-500 bp)具有很高的分辨能力。另一方面,琼脂糖凝胶对DNA的分辨力较低,但分离范围较大,因此通常用于大小为50–20,000 bp的DNA片段,但脉冲场的分辨率可能超过6 Mb凝胶电泳(PFGE)。聚丙烯酰胺凝胶以垂直构型运行,而琼脂糖凝胶通常以潜艇模式水平运行。它们的浇铸方法也不同,因为琼脂糖会热定形,而聚丙烯酰胺会在化学聚合反应中形成。

琼脂糖

琼脂糖凝胶由从海藻中提取的天然多糖 聚合物制成。与其他基质相比,琼脂糖凝胶易于浇铸和处理,因为凝胶的凝结是物理的而不是化学的变化。样品也很容易回收。实验完成后,可以将所得凝胶保存在冰箱塑料袋中。

琼脂糖凝胶的孔径不均一,但是对于电泳大于200 kDa的蛋白质来说是最佳选择。琼脂糖凝胶电泳还可用于分离从50个碱基对到几个兆碱基(百万个碱基)的DNA片段,其中xxx的片段需要专门的仪器。凝胶中琼脂糖的百分比会影响不同长度的DNA条带之间的距离,而更高的百分比则需要更长的运行时间,有时甚至是几天。相反,应使用脉冲场电泳(PFE)或场反向电泳运行高百分比的琼脂糖凝胶。

“大多数琼脂糖凝胶是用溶解在电泳缓冲液中的琼脂糖的0.7%(好的分离或分离大的5-10kb DNA片段)和2%(好的分离度为0.2-1kb的小片段)制备的。最多可使用3%的琼脂糖凝胶。分离非常小的碎片,但在这种情况下,更适合使用垂直聚丙烯酰胺凝胶;低百分比的凝胶非常弱,当您提起它们时可能会破裂;高百分比的凝胶通常会变脆并且不能均匀固定;通常1%的凝胶许多应用程序。”

聚丙烯酰胺

由于聚丙烯酰胺凝胶提供的均匀孔径,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)可用于分离大小为5至2,000 kDa的蛋白质。通过调节用于产生凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺粉末的浓度来控制孔径。制作这种类型的凝胶时必须小心,因为丙烯酰胺是一种有效的神经毒素,呈液态和粉状。

传统的DNA测序技术(例如Maxam-Gilbert或Sanger方法)使用聚丙烯酰胺凝胶分离长度相差一个碱基对的DNA片段,从而可以读取序列。现在,除特别小的DNA片段外,大多数现代DNA分离方法都使用琼脂糖凝胶。目前,它最常用于免疫学和蛋白质分析领域,通常用于将不同的蛋白质或同一蛋白质的同工型分离成单独的条带。可以将它们转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上,以用抗体和相应的标记物(例如在Western blot中)进行探测。

通常,分辨凝胶以6%、8%、10%、12%或15%制成。将堆积的凝胶(5%)倒在分离的凝胶上,并插入凝胶梳(形成孔并定义将放置蛋白质,样品缓冲液和梯子的泳道)。选择的百分比取决于人们希望鉴定或探测的蛋白质的大小。已知重量越小,应使用的百分比越高。凝胶缓冲系统的变化可以帮助进一步分离非常小的蛋白质。

缓冲区

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凝胶电泳中的缓冲液用于提供载有电流的离子,并将pH保持在相对恒定的值。这些缓冲液中含有大量离子,这是电流通过它们所必需的。诸如蒸馏水或苯之类的离子几乎不含离子,这对于电泳而言并不理想。有许多用于电泳的缓冲液。对于核酸Tris /乙酸盐/ EDTA(TAE)、Tris /硼酸盐/ EDTA(TBE),最常见。已经提出了许多其他缓冲剂,例如硼酸锂,基于Pubmed引用(LB)、等电组氨酸、pK匹配的商品缓冲液等很少使用;在大多数情况下,据称原理是较低的电流(较少的热量)匹配的离子迁移率,从而导致更长的缓冲寿命。硼酸盐有问题;硼酸盐可以聚合顺式二醇,或与顺式二醇相互作用,例如在RNA中发现的那些。TAE的缓冲能力最低,但对较大的DNA提供最佳分辨率。这意味着更低的电压和更多的时间,但是更好的产品。LB相对较新,无法解析大于5 kbp的片段。但是,由于其低电导率,可以使用更高的电压(最高35 V / cm),这意味着可以缩短常规电泳的分析时间。

大多数SDS-PAGE蛋白分离是使用“不连续”(或DISC)缓冲系统进行的,该系统显着增强了凝胶中条带的清晰度。在不连续凝胶系统中进行电泳的过程中,在电泳的早期会形成离子梯度,这会导致所有蛋白质在称为等速电泳的过程中集中在一条清晰的条带上。在凝胶的下部“分离”区域中按大小分离蛋白质。分离凝胶的孔径通常要小得多,这会导致筛分效应,该效应现在决定了蛋白质的电泳迁移率。

可视化

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电泳完成后,可以对凝胶中的分子进行染色以使其可见。可以使用溴化乙锭对DNA进行可视化,当插入到DNA中时,可以在紫外光下发出荧光,而使用银染或考马斯亮蓝染料可以对蛋白质进行可视化。也可以使用其他方法来可视化凝胶上混合物成分的分离。如果要分离的分子具有放射性,例如在DNA测序凝胶中,则可以记录凝胶的放射自显影照片。 照片可以采取凝胶,经常使用Gel Doc系统。


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  1. 凝胶电泳
  2. 凝胶类型
  3. 琼脂糖
  4. 聚丙烯酰胺
  5. 缓冲区
  6. 可视化

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