荧光光谱

橄榄光谱（也称为荧光测定法或荧光分光光度计）是一种分析样品荧光的电磁光谱学。 它涉及使用一束光，通常是紫外线，激发某些化合物分子中的电子并使它们发光； 通常但不一定是可见光。 一种补充技术是吸收光谱。 在单分子荧光光谱的特殊情况下，发射光的强度波动是从单个荧光团或荧光团对测量的。

测量荧光的设备称为荧光计。

分子具有称为能级的各种状态。 荧光光谱主要关注电子和振动状态。 通常，被检查的物质具有感兴趣的基电子态（低能态）和较高能的激发电子态。 在这些电子状态中的每一个中，都有各种振动状态。

在荧光中，物质首先通过吸收光子从其基态电子状态激发到处于激发电子状态的各种振动状态之一。 与其他分子的碰撞导致激发分子失去振动能量，直到它从激发电子态达到最低振动状态。

然后分子再次下降到基电子态的各种振动水平之一，在此过程中发射光子。 由于分子可能会下降到基态的几个振动能级中的任何一个，因此发射的光子将具有不同的能量，从而具有不同的频率。 因此，通过分析荧光光谱中发出的不同频率的光，以及它们的相对强度，可以确定不同振动能级的结构。

对于原子种类，过程是相似的； 然而，由于原子种类没有振动能级，因此发射的光子通常与入射辐射处于相同的波长。 这种重新发射吸收的光子的过程是共振荧光，虽然它是原子荧光的特征，但也可以在分子荧光中看到。

在典型的荧光（发射）测量中，激发波长是固定的，而检测波长是变化的，而在荧光激发测量中，检测波长是固定的，而激发波长在感兴趣的区域中是变化的。 发射图是通过记录一系列激发波长产生的发射光谱并将它们组合在一起来测量的。 这是一个三维表面数据集：作为激发和发射波长函数的发射强度，通常描绘为等高线图。

存在两种通用类型的仪器：使用滤光片隔离入射光和荧光的滤光荧光计，以及使用衍射光栅单色器隔离入射光和荧光的分光荧光计。

两种类型都使用以下方案：来自激发源的光通过滤光片或单色仪，然后照射到样品上。 一部分入射光被样品吸收，样品中的一些分子发出荧光。 荧光向所有方向发射。 部分荧光通过第二个滤光片或单色仪到达检测器，该检测器通常与入射光束成 90°，以xxx限度地降低透射或反射入射光到达检测器的风险。

可以使用各种光源作为激发源，包括激光、LED和灯； 尤其是氙弧灯和水银灯。 激光器仅在非常窄的波长间隔内发射高辐照度的光，通常低于 0.01 nm，这使得激发单色器或滤光片变得不必要。 这种方法的缺点是激光的波长不能改变太多。 汞蒸气灯是一种线灯，这意味着它发出的光接近峰值波长。 相比之下，氙弧具有连续的发射光谱，在 300-800 nm 范围内强度几乎恒定，并且辐照度足以测量低至 200 nm 以上。

滤光片和/或单色仪可用于荧光计。 单色仪传输具有可调公差的可调波长的光。 最常见的单色仪类型使用衍射光栅，即准直光照射光栅并根据波长以不同角度出射。 然后可以调整单色仪以选择要传输的波长。 为了进行各向异性测量，需要添加两个偏振滤光片：一个在激发单色仪或滤光片之后，一个在发射单色仪或滤光片之前。