4Pi显微镜

4Pi显微镜是一种具有改进的轴向分辨率的激光扫描荧光显微镜。 有了它，轴向分辨率的典型范围 500-700 nm 可以提高到 100-150 nm，这对应于一个几乎球形的焦斑，其体积比标准共聚焦显微镜小 5-7 倍。

分辨率的提高是通过使用两个相对的物镜实现的，它们都聚焦在相同的几何位置。 此外，通过两个物镜中的每一个的光程长度差异都经过仔细对齐，以达到最小。 通过这种方法，驻留在两个物镜的共同焦点区域中的分子可以从两侧被相干地照亮，并且反射或发射的光也可以被相干地收集，即发射光在检测器上的相干叠加是可能的。 用于照明和检测的立体角 Ω {displaystyle Omega } 增加并接近其xxx值。 在这种情况下，样品会同时从所有侧面被照射和检测。

4Pi显微镜的工作模式如图所示。 激光由分束器分开，并由反射镜引导至两个相对的物镜。 在两个聚焦光束的共同焦点处发生叠加。 这个位置的激发分子发出荧光，荧光由两个物镜收集，由同一个分束器组合并由二向色镜偏转到检测器上。 两个发射光路的叠加可以再次发生。

在理想情况下，每个物镜都可以从 Ω = 2 π {displaystyle Omega =2pi } 的立体角收集光线。 使用两个物镜，可以从各个方向收集（立体角 Ω = 4 π {displaystyle Omega =4pi } ）。 这种显微镜的名称来源于激发和检测的xxx可能立体角。 实际上，物镜的孔径角只能达到约 140°，对应于 Ω ≈ 1.3 π {displaystyle Omega approx 1.3pi } 。

显微镜可以三种不同的方式操作：在 A 型 4Pi 显微镜中，激发光的相干叠加用于产生更高的分辨率。 发射光要么仅从一侧检测到，要么从两侧检测到非相干叠加。 在 B 型 4Pi 显微镜中，只有发射光会产生干扰。 当在 C 型模式下操作时，激发光和发射光都被允许干涉，从而导致尽可能高的分辨率增加（与共聚焦显微镜相比，沿着光轴约 7 倍）。

在真正的 4Pi 显微镜中，光不能均匀地从所有方向应用或收集，从而导致点扩散函数中出现所谓的旁瓣。 通常（但不总是）双光子激发显微镜在 4Pi 显微镜中与发射针孔结合使用，以将这些旁瓣降低到可容忍的水平。

1971 年，Christoph Cremer 和 Thomas Cremer 提议创建一个完美的全息图，即携带点源在各个方向发射的整个场信息的全息图，即所谓的 4 π {displaystyle 4pi } 全息图。 然而，1978 年的出版物得出了一个不正确的物理结论（即点状光斑），并且完全忽略了轴向分辨率增加是增加立体角另一侧的实际好处。 Stefan Hell 于 1991 年发明了 4Pi 显微镜实用系统的xxx个描述，即具有两个相对的干涉透镜的装置。他在 1994 年通过实验证明了它。

在接下来的几年里，这种显微镜的应用数量不断增加。 例如，样品中 64 个点的平行激发和检测同时结合改进的空间分辨率，导致 2002 年用 4Pi 显微镜成功记录了酵母细胞中线粒体的动态。

到目前为止，4Pi 显微镜的最佳质量是结合受激发射耗尽 (STED) 原理等超分辨率技术实现的。 使用具有适当激发和去激发光束的 4Pi 显微镜，可以创建一个统一的 50 nm 大小的光斑，这对应于与共聚焦显微镜相比，固定细胞中聚焦体积减小了 150-200 倍。 通过将 4Pi 显微镜和具有可切换蛋白质的 RESOLFT 显微镜相结合，现在可以在低光照水平下以低于 40 nm 的各向同性分辨率拍摄活细胞图像。