分子克隆

分子克隆是分子生物学中的一套实验方法，用于组装重组 DNA 分子并指导它们在宿主生物体内的复制。 克隆一词的使用是指该方法涉及复制一个分子以产生具有相同 DNA 分子的细胞群。 分子克隆通常使用来自两种不同生物的 DNA 序列：作为要克隆 DNA 来源的物种，以及将作为重组 DNA 复制的活宿主的物种。 分子克隆方法是现代生物学和医学的许多当代领域的核心。

在传统的分子克隆实验中，要克隆的 DNA 从感兴趣的生物体中获得，然后在试管中用酶处理以产生更小的 DNA 片段。 随后，将这些片段与载体 DNA 结合，生成重组 DNA 分子。 然后将重组 DNA 引入宿主生物体（通常是易于生长的良性实验室大肠杆菌菌株）。 这将产生一个生物体群体，其中重组 DNA 分子与宿主 DNA 一起复制。 因为它们含有外源 DNA 片段，所以它们是转基因或转基因微生物 (GMO)。 这个过程利用了这样一个事实，即可以诱导单个细菌细胞吸收并复制单个重组 DNA 分子。 然后这个单细胞可以呈指数增长，产生大量细菌，每个细菌都含有原始重组分子的拷贝。 因此，由此产生的细菌种群和重组 DNA 分子通常都称为克隆。 严格地说，重组DNA是指DNA分子，而分子克隆是指将它们组装起来的实验方法。 出现了这样的想法，即可以将不同的 DNA 序列插入质粒中，并且这些外来序列将被携带到细菌中并作为质粒的一部分被消化。 也就是说，这些质粒可以作为携带基因的克隆载体。

事实上，任何 DNA 序列都可以被克隆和扩增，但有一些因素可能会限制该过程的成功。 难以克隆的 DNA 序列的例子有反向重复序列、复制起点、着丝粒和端粒。 插入大尺寸 DNA 序列时，成功的机会也较低。 大于 10kbp 的插入成功率非常有限，但可以修改噬菌体（例如噬菌体 λ）以成功插入长达 40kbp 的序列。

在 1970 年代之前，由于无法从复杂生物体中分离和研究单个基因，对遗传学和分子生物学的理解受到严重阻碍。 随着分子克隆方法的出现，这种情况发生了巨大变化。 微生物学家试图了解细菌限制噬菌体生长的分子机制，分离出限制性核酸内切酶，这种酶只有在遇到特定的 DNA 序列时才能切割 DNA 分子。 他们表明，限制酶在特定位置切割染色体长度的 DNA 分子，并且较大分子的特定部分可以通过大小分级分离来纯化。 使用第二种酶，即 DNA 连接酶，可以将限制酶产生的片段连接成新的组合，称为重组 DNA。 通过将感兴趣的 DNA 片段与在细菌内自然复制的载体 DNA（例如噬菌体或质粒）重组，可以在细菌培养物中产生大量纯化的重组 DNA 分子。 1972 年产生并研究了xxx个重组 DNA 分子。

分子克隆利用了 DNA 的化学结构在所有生物体中基本相同的事实。 因此，如果将来自任何生物体的任何 DNA 片段插入包含 DNA 复制所需分子序列的 DNA 片段，并将所得重组 DNA 引入从中获得复制序列的生物体中，则外来 DNA 将被复制 以及转基因生物中宿主细胞的 DNA。

分子克隆类似于聚合酶链反应 (PCR)，因为它允许复制 DNA 序列。 这两种方法的根本区别在于，分子克隆涉及在活微生物中复制 DNA，而 PCR 是在不含活细胞的体外溶液中复制 DNA。

在实验室进行实际的克隆实验之前，大多数克隆实验都是在计算机上使用专门的软件进行计划的。