染色质免疫沉淀-测序

ChIP 测序，也称为 ChIP-seq，是一种用于分析蛋白质与 DNA 相互作用的方法。 ChIP-seq 将染色质免疫沉淀 (ChIP) 与大规模平行 DNA 测序相结合，以确定 DNA 相关蛋白的结合位点。 它可用于精确定位任何感兴趣的蛋白质的全局结合位点。 以前，ChIP-on-chip 是用于研究这些蛋白质-DNA 关系的最常用技术。

ChIP-seq 主要用于确定转录因子和其他染色质相关蛋白如何影响表型影响机制。 确定蛋白质如何与 DNA 相互作用以调节基因表达对于充分了解许多生物过程和疾病状态至关重要。 这种表观遗传信息与基因型和表达分析相辅相成。 ChIP-seq 技术目前主要被视为需要杂交阵列的 ChIP 芯片的替代品。 这引入了一些偏差，因为阵列仅限于固定数量的探针。 相比之下，测序被认为具有较少的偏差，尽管不同测序技术的测序偏差尚未完全了解。

与转录因子和其他蛋白质直接物理相互作用的特定 DNA 位点可以通过染色质免疫沉淀法分离。 ChIP 生成与感兴趣的蛋白质结合的目标 DNA 位点库。 大规模平行序列分析与全基因组序列数据库结合使用，以分析任何蛋白质与 DNA 的相互作用模式，或任何表观遗传染色质修饰的模式。 这可以应用于一组可进行 ChIP 的蛋白质和修饰，例如转录因子、聚合酶和转录机制、结构蛋白、蛋白质修饰和 DNA 修饰。 作为依赖特定抗体的替代方法，已经开发出不同的方法来寻找基因组中所有核小体耗尽或核小体破坏的活性调节区域的超集，如 DNase-Seq 和 FAIRE-Seq。

ChIP 是一种强大的方法，可以选择性地富集活细胞中特定蛋白质结合的 DNA 序列。 然而，由于缺乏足够强大的方法来识别所有富集的 DNA 序列，这种方法的广泛使用受到限制。 ChIP 湿实验室协议包含 ChIP 和杂交。 ChIP 协议基本上有五个部分，有助于更好地理解 ChIP 的整个过程。 为了进行 ChIP，xxx步是使用甲醛和大量 DNA 进行交联以获得有用的量。 交联发生在蛋白质和 DNA 之间，也发生在 RNA 和其他蛋白质之间。 第二步是染色质碎裂过程，将染色质打碎，最终获得用于 ChIP 分析的高质量 DNA 片段。 应将这些片段切割成每个片段少于 500 个碱基对，以获得基因组作图的最佳结果。 第三步称为染色质免疫沉淀，这是 ChIP 的简称。 ChIP 过程使用针对目标蛋白质的抗体增强特异性交联的 DNA-蛋白质复合物，然后孵育和离心以获得免疫沉淀。 免疫沉淀步骤还允许去除非特异性结合位点。 第四步是 DNA 回收和纯化，通过对 DNA 和蛋白质之间交联的反向作用将它们分离并通过提取清洁 DNA 来进行。

第五步也是最后一步是通过 qPCR、ChIP-on-chip（混合阵列）或染色质免疫沉积-测量过程对 ChIP 协议进行的分析步骤。 然后将寡核苷酸接头添加到与感兴趣的蛋白质结合的小段 DNA 中，以实现大规模并行测序。 通过分析，然后可以通过蛋白质结合的基因或区域来识别和解释序列。

选择大小后，使用基因组测序仪同时对所有生成的 ChIP-DNA 片段进行测序。 单次测序运行可以扫描高分辨率的全基因组关联，这意味着可以在染色体上精确定位特征。 相比之下，ChIP 芯片需要大量的平铺阵列来获得较低的分辨率。

在这个测序步骤中使用了许多新的测序方法。 一些分析序列的技术可以在固体流动槽基质上使用接头连接的 ChIP DNA 片段的簇扩增来创建每个约 1000 个克隆拷贝的簇。 通过基因组分析程序对流动池表面上生成的高密度模板簇阵列进行测序。 每个模板簇使用新型荧光标记的可逆终止核苷酸并行进行边合成边测序。