CRISPR

CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列）是出现在许多细菌和古细菌基因组中的重复 DNA（重复）片段。 它们服务于一种机制，即 CRISPR/Cas 系统，该系统赋予对病毒或质粒入侵的抵抗力，因此是免疫系统的一部分，相当于许多原核生物。 该系统构成了用于生成转基因生物的 CRISPR/Cas 基因工程方法的基础。

CRISPR 基因座基本上由两个主要部分组成：包含 cas 基因的 cas 操纵子和由前导序列和重复间隔序列（也称为重复间隔阵列）组成的 CRISPR 阵列。

重复基本基序（重复）的各个序列的长度在 23 到 47 bp 之间变化。 重复序列与长度为 21 至 72 bp 的间隔区交替出现。 虽然重复序列保留在 CRISPR 结构中，但 CRISPR 的序列在不同的微生物中差异很大。 细菌 CRISPR 重复序列通常是回文序列（即镜像倒置互补），导致相关 RNA 的二级结构稳定，而大多数古细菌重复序列不是回文序列。

无论是在 CRISPR 结构内还是在不同的原核生物中，间隔片段的序列差异很大。 2005 年，人们发现间隔区序列与来自噬菌体和质粒的外来 DNA 相同。 这导致了 CRISPR 的功能是保护生物体免受外来 DNA 侵害的假设。

cas操纵子也属于CRISPR基因位点。 cas 操纵子包含 cas 基因和要编码的蛋白质，它们是适应性免疫反应所必需的，例如 B. 解旋酶、核酸酶，以及具有 RNA 结合特性的蛋白质。 cas基因可分为两个模块：效应模块和适应模块。 效应模块是一组用于识别遗传物质的cas基因。 适应模块还包含 cas 基因并使用效应蛋白来促进可以整合到细菌基因组中的原型间隔子选择。

所谓的前导序列位于重复间隔序列附近。 前导序列是一个富含腺嘌呤和胸腺嘧啶的序列，长度为 100-500 bp。 与重复一样，基因组中的前导序列大约有 80% 相同，但在不同的每个有机体都表现出很大的差异。 作为一个非编码序列，它可以分为两个区域：核心前导和扩展前导。 核心前导序列在几种生物体中是保守的，通常比扩展前导序列短，长度为 20-300 bp。 此外，核心领导者有一个启动子元件，调节蛋白可以与之结合，以便能够控制基因表达，更准确地说是 CRISPR 转录的启动和间隔子获取。

延伸前导长度为 50-500 bp，比核心前导长，并且还包含 CRISPR 远距离区域中的保守序列，这可能是通过基因复制产生的。 扩展领导者的功能目前未知。 扩展领导者可能没有重要的功能。

尽管近年来取得了重大进展，但 CRISPR/Cas 系统赋予原核生物免疫力的机制仍不清楚。 假设在免疫过程中，外源DNA被Cas蛋白复合物识别并作为新的间隔区整合到CRISPR区域。 这些过程如何详细发生尚未完全阐明。

CRISPR/Cas 系统能够通过在 CRISPR 阵列的重复序列之间整合外源 DNA 序列（所谓的间隔子）来修改细菌和古细菌的基因组。 这个过程称为适应或间隔子获取。 适配可分为两个阶段：

• 从外来 DNA 中捕获间隔序列（所谓的原型间隔），
• 间隔整合。

除了一些例外，适应机制已在大肠杆菌 CRISPR/Cas 系统 I 型中进行了详细研究。 适应的关键参与者由 cas1 和 cas2 基因编码，它们在不同的 CRISPR/Cas 系统类型中是保守的。

适应的第 一阶段，即从外来 DNA 中捕获间隔序列，可以在 I 型 CRISPR/Cas 系统中以两种模式发生：幼稚或启动。 在天真适应的情况下，只有蛋白质 Cas1 和 Cas2 是捕获间隔子所必需的，而引发的适应取决于已经存在的间隔子（引发间隔子），因此对哪些间隔子被整合到基因组中进行了预选。 除了蛋白质 Cas1 和 Cas2 之外，还需要由 Cas 蛋白质（干扰复合物 I 型，级联）和 Cas3 核酸酶组成的蛋白质复合物。 其他 CRISPR/Cas 系统类型编码额外的蛋白质以适应。

引发适应的机制始于 crRNA 结合蛋白复合物级联（用于抗病毒防御的 CRISPR 相关复合物）通过促进一维扩散（沿 DNA 滑动）与入侵 DNA 的原型间隔区相邻基序 (PAM) 的结合) 和 3D 扩散（跳跃）。 在 Cascade 弯曲和展开 DNA 后，crRNA 和 Cascade 结合的 DNA 链的互补碱基配对导致 R 环的形成。