荧光原位杂交

荧光原位杂交 (FISH) 是一种分子细胞遗传学技术，它使用荧光探针仅结合具有高度序列互补性的核酸序列的特定部分。 它由生物医学研究人员在 80 年代初期开发，用于检测和定位染色体上特定 DNA 序列的存在与否。 荧光显微镜可用于找出荧光探针与染色体结合的位置。 FISH 通常用于寻找 DNA 中的特定特征，用于遗传咨询、医学和物种鉴定。 FISH 还可用于检测和定位细胞、循环肿瘤细胞和组织样本中的特定 RNA 靶标（mRNA、lncRNA 和 miRNA）。 在这种情况下，它可以帮助定义细胞和组织内基因表达的时空模式。

在生物学中，探针是与感兴趣的核苷酸序列互补的单链 DNA 或 RNA。

可以针对任何基因或基因内的任何序列设计 RNA 探针，以可视化组织和细胞中的 mRNA、lncRNA 和 miRNA。 FISH 用于检查细胞繁殖周期，特别是细胞核间期是否存在任何染色体异常。 FISH 允许分析大量档案案例，通过创建具有吸引相似染色体的人工染色体基础的探针，更容易识别精确定位的染色体。 当检测到核酸异常时，每个探针的杂交信号。 每个用于检测 mRNA 和 lncRNA 的探针由约 20-50 个寡核苷酸对组成，每对覆盖 40-50 bp 的空间。 具体细节取决于所使用的特定 FISH 技术。 对于 miRNA 检测，探针使用专有化学方法对 miRNA 进行特异性检测，并覆盖整个 miRNA 序列。

探针通常源自分离、纯化和扩增用于人类基因组计划的 DNA 片段。 与可以直接测序的长度相比，人类基因组的大小是如此之大，以至于有必要将基因组分成片段。为了保存片段及其各自的 DNA 序列，将片段添加到一个不断复制细菌种群的系统中。 细菌的克隆种群，每个种群都保持一条人工染色体，储存在世界各地的各个实验室中。 可以在任何包含文库的实验室中培养、提取和标记人工染色体 (BAC)。 基因组文库通常以开发它们的机构命名。这些片段大约有 10 万个碱基对，是大多数 FISH 探针的基础。

使用 RNA FISH 的目的是检测细胞、组织切片甚至整片中的目标 mRNA 转录本。 该过程分为 3 个主要步骤：组织制备（杂交前）、杂交和洗涤（杂交后）。

组织制备首先收集适当的组织切片以进行 RNA FISH。 首先，固定细胞、循环肿瘤细胞 (CTC)、福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 或冷冻组织切片。 一些常用的固定剂是磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的 4% 甲醛或多聚甲醛 (PFA)。 FISH 也已在未固定的细胞上成功完成。 固定后，样品被透化以允许杂交试剂渗透。

杂交过程必须具备所有最佳条件才能获得成功的原位结果，包括温度、pH、盐浓度和杂交反应时间。 检查所有必要条件后，可以开始杂交步骤，首先添加一个由 20 个寡核苷酸对组成的目标特异性探针，与目标 RNA 杂交。 独立但兼容的信号放大系统支持多重检测（每次检测最多两个靶标）。 信号放大是通过一系列顺序杂交步骤实现的。