光学切片

光学切片是通过适当设计的显微镜可以在厚样品内部深处产生焦平面的清晰图像的过程。这用于减少使用切片机等仪器进行薄切片的需求。使用了许多不同的光学切片技术，并且专门设计了几种显微镜技术来提高光学切片的质量。

良好的光学切片（通常称为良好的深度或z分辨率）在现代显微镜中很流行，因为它可以根据在不同焦平面捕获的图像对样品进行三维重建。

在理想的显微镜中，只有来自焦平面的光才能进入检测器（通常是观察者或CCD），以产生显微镜所聚焦的样品平面的清晰图像。不幸的是，显微镜并非如此，来自焦平面以外的光源的光也到达检测器。在厚样品中，在焦平面和物镜之间可能存在大量物质，因此产生了虚假信号。

在不对显微镜进行任何修改的情况下（即使用简单的宽视场光学显微镜），光学切片的质量由与摄影中的景深效果相同的物理学决定。对于高数值孔径的镜头（相当于宽孔径）、景深较小（浅焦点），并且可以提供良好的光学剖面。高倍率的物镜通常比低倍率的物镜具有更高的数值孔径（因此具有更好的光学截面）。油浸物镜通常具有更大的数值孔径，因此可以改善光学截面。

除了增加数值孔径外，很少有技术可用于改善明场光学显微镜中的光学切片。由于折射极限，大多数具有油浸物镜的显微镜都达到了数值孔径的极限。

差分干涉对比（DIC）对光学切片提供了适度的改进。在DIC中，样品由两个稍微偏移的光源有效地照明，然后这些光源相互干扰以产生由两个光源的相位差产生的图像。由于光源中的偏移很小，因此相位的xxx差异是由靠近焦平面的材料引起的。

在荧光显微镜下，焦平面外的物体只有在被照明并发出荧光时才会干扰图像。这增加了一种额外的方式，通过使照明仅针对焦平面，可以改善光学切片效果。

共聚焦显微镜使用一个或多个扫描点照亮样品。结合共轭焦平面上的针孔，此功能可滤除焦平面外部光源发出的光，从而改善光学切片效果。

基于光片的荧光显微术用与观察方向成90°角的激发光照射样品，即使用仅在一个方向聚焦的激光（光片）仅照射焦平面。与落射荧光显微镜相比，该方法有效地减少了散焦光，并可能导致纵向分辨率的适度提高。

双光子和多光子激发技术利用了以下事实：荧光团不仅可以由具有正确能量的单个光子激发，而且可以由共同提供正确能量的多个光子激发。需要多个光子同时与荧光团相互作用的“依赖于浓度”的附加效应仅在非常靠近焦平面的位置提供刺激。这些技术通常与共聚焦显微镜结合使用。

光学切片方面的进一步改进正在积极开发中，这些原理主要是通过规避光的衍射极限的方法来进行的。例子包括通过两个物镜的单光子干涉术，以给出关于单个荧光团的极准确的深度信息和三维结构照明显微镜。

普通的广角显微镜的光学截面可以通过反卷积得到显着改善，反卷积是一种根据测量或计算出的点扩散函数消除图像模糊的图像处理技术。

光学切片可以通过使用具有高折射率（> 1.4）的清洁剂来增强，例如苄醇/苯甲酸苄酯（BABB）或苄醚，这些透明剂可以使标本透明，从而可以观察内部结构。

在非光学显微镜中，光学切片的开发不足。

X射线和电子显微镜通常具有较大的景深（较差的光学切片），因此薄样品切片仍被广泛使用。

尽管相似的物理学指导聚焦过程，但在光学切片的背景下通常不讨论扫描探针显微镜和扫描电子显微镜，因为这些显微镜仅与样品表面相互作用。

全内反射显微镜是一种荧光显微镜技术，它有意将观察范围限制在样品的顶部或底部，但具有极高的深度分辨率。

从理论上和实验上都证明了结合使用聚焦截面和倾斜的3D成像，以便在大视野范围内提供出色的3D分辨率。

光学切片的主要替代方法是：

• 样品的薄切片，例如用于组织学中的切片。
• 断层扫描，特别为透射电子显微镜研制。