等电位聚焦

等电位聚焦 (IEF)，也称为电聚焦，是一种通过等电点 (pI) 的差异来分离不同分子的技术。 它是一种区域电泳，通常在凝胶中的蛋白质上进行，它利用了目标分子的总电荷是其周围环境 pH 值的函数这一事实。

IEF 涉及将两性电解质溶液添加到固定化 pH 梯度 (IPG) 凝胶中。 IPG 是与 pH 梯度共聚的丙烯酰胺凝胶基质，除了最碱性 (＞12) 的 pH 值外，它会产生完全稳定的梯度。 固定化 pH 梯度是通过固定化物比例的连续变化获得的。 不动素是由其 pK 值定义的弱酸或弱碱。

处于低于其等电点 (pI) 的 pH 范围内的蛋白质将带正电，因此将向阴极（带负电的电极）迁移。 然而，当它通过增加 pH 的梯度迁移时，蛋白质的总电荷将减少，直到蛋白质达到与其 pI 对应的 pH 区域。 此时它没有净电荷，因此迁移停止（因为对任一电极都没有电吸引力）。 结果，蛋白质变得聚焦成尖锐的固定条带，每个蛋白质位于与其 pI 对应的 pH 梯度中的一个点。 该技术能够实现极高的分辨率，蛋白质因单个电荷而不同，被分成不同的条带。

要聚焦的分子分布在具有 pH 梯度（通常由脂肪族两性电解质产生）的介质中。 电流通过介质，形成正阳极和负阴极端。 带负电的分子通过介质中的 pH 梯度向正端移动，而带正电的分子向负端移动。 当一个粒子向与其电荷相反的极移动时，它会通过不断变化的 pH 梯度移动，直到它到达一个点，在这个点上，该分子的 pH 值达到等电点。 此时分子不再具有净电荷（由于相关官能团的质子化或去质子化），因此不会在凝胶内进一步进行。 通过首先对具有不同 pI 值的小分子溶液（例如聚两性电解质）进行电泳，在添加感兴趣的颗粒之前建立梯度。

该方法特别常用于蛋白质研究，蛋白质根据酸性和碱性残基的相对含量进行分离，其值由 pI 表示。 将蛋白质引入由聚丙烯酰胺、淀粉或琼脂糖组成的固定化 pH 梯度凝胶中，其中已建立 pH 梯度。 大孔凝胶通常用于此过程，以消除任何筛分效应，或由不同大小的蛋白质的不同迁移率引起的 pI 中的伪影。 等位聚焦可以分辨 pI 值差异小至 0.01 的蛋白质。 等电位聚焦是二维凝胶电泳的xxx步，首先通过pI值分离蛋白质，然后通过SDS-PAGE进一步根据分子量分离。

根据一些观点，活的真核细胞在其内部进行蛋白质的等电聚焦，以克服酶及其反应物扩散对代谢反应速率的限制，并调节特定生化过程的速率。 通过将特定代谢途径的酶集中到其内部不同的小区域，细胞可以将特定生化途径的速率提高几个数量级。 通过例如磷酸化或去磷酸化改变酶分子的等电点 (pI)，细胞可以在其内部的不同部分之间转移酶分子，以开启或关闭特定的生化过程。

基于微芯片的电泳是毛细管电泳的一种有前途的替代方法，因为它有可能提供快速蛋白质分析、与其他微流体单元操作的直接集成、全通道检测、硝酸纤维素膜、更小的样本量和更低的制造成本。

对更快、更易于使用的蛋白质分离工具的需求增加，加速了 IEF 向溶液内分离的发展。 在这种情况下，开发了一种多结 IEF 系统来执行快速且无凝胶的 IEF 分离。 多接头 IEF 系统使用一系列容器，毛细管穿过每个容器。 每个容器中的部分毛细管被半透膜代替。 容器包含具有不同 pH 值的缓冲溶液，以便在毛细管内有效地建立 pH 梯度。