基因敲除

基因敲除（缩写：KO）是一种遗传技术，其中使生物体的一个基因失效（从生物体中敲除）。然而，基因敲除也可以指被敲除的基因或携带基因敲除的生物体。

基因敲除生物或简单的基因敲除用于研究基因功能，通常是通过研究基因丢失的影响。研究人员通过基因敲除生物体与正常个体的差异进行推论。

基因敲除技术本质上与基因敲入相反。在生物体中同时敲除两个基因被称为双敲除 (DKO)。类似地，术语三重敲除 (TKO) 和四重敲除 (QKO) 分别用于描述三个或四个被敲除的基因。

然而，需要区分杂合子和纯合子基因敲除。在前者中，两个基因拷贝（等位基因）中只有一个被敲除，在后者中两个都被敲除。

敲除是通过多种技术完成的。最初，确定了自然发生的突变，然后必须通过 DNA 测序或其他方法确定基因丢失或失活。

传统上，同源重组是导致基因敲除的主要方法。该方法涉及创建包含所需突变的 DNA 构建体。出于敲除目的，这通常涉及用耐药标记代替所需的敲除基因。

该构建体还将包含与目标序列至少 2kb 的同源性。可以通过显微注射或电穿孔将构建体递送至干细胞。然后，该方法依靠细胞自身的修复机制将 DNA 结构重组为现有 DNA。

这导致基因的序列被改变，并且大多数情况下基因将被翻译成无功能的蛋白质，如果它被翻译的话。然而，这是一个低效的过程，因为同源重组仅占 DNA 整合的 10-2 到 10-3。通常，构建体上的药物选择标记用于选择发生重组事件的细胞。

这些现在缺乏该基因的干细胞可以在体内使用，例如在小鼠中，方法是将它们插入早期胚胎。如果由此产生的嵌合小鼠在其种系中包含遗传变化，则可以将其传递给后代。

在大多数基因包含两个等位基因的二倍体生物体中，还可能包含几个以相同角色协作的相关基因，进行额外轮次的转化和选择，直到每个目标基因都被敲除。可能需要选择性育种来产生纯合基因敲除动物。

目前使用三种方法涉及精确定位 DNA 序列以引入双链断裂。一旦发生这种情况，细胞的修复机制将尝试修复这种双链断裂，通常是通过非同源末端连接 (NHEJ)，这涉及将两个切割末端直接连接在一起。

这可能做得不完美，因此有时会导致碱基对的插入或缺失，从而导致移码突变。这些突变可以使它们所在的基因失去功能，从而产生该基因的敲除。这个过程比同源重组更有效，因此可以更容易地用于创建双等位基因敲除。

锌指核酸酶由可以精确靶向 DNA 序列的 DNA 结合域组成。每个锌指都可以识别所需 DNA 序列的密码子，因此可以模块化组装以与特定序列结合。这些结合域与限制性核酸内切酶偶联，可导致 DNA 中的双链断裂 (DSB)。修复过程可能会引入破坏基因功能的突变。

转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 也包含一个 DNA 结合域和一个可以切割 DNA 的核酸酶。DNA 结合区由氨基酸重复组成，每个氨基酸重复识别所需目标 DNA 序列的单个碱基对。

如果这种切割针对基因编码区，并且 NHEJ 介导的修复引入了插入和缺失，则通常会导致移码突变，从而破坏基因的功能。

成簇规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)/Cas9 是一种基因组编辑方法，其中包含与 Cas9 蛋白复合的指导 RNA。指导 RNA 可以通过简单的互补碱基配对来设计以匹配所需的 DNA 序列，这与锌指或 TALEN 所需的耗时的构建体组装相反。偶联的 Cas9 将导致 DNA 双链断裂。