柠檬酸合成酶

柠檬酸合成酶 E.C. 2.3.3.1（以前的 4.1.3.7）存在于几乎所有活细胞中，并且在柠檬酸循环（或克雷布斯循环）的xxx步中充当起搏酶。 柠檬酸合成酶定位于线粒体基质的真核细胞内，但由核 DNA 而不是线粒体编码。 它使用细胞质核糖体合成，然后转运到线粒体基质中。

柠檬酸合成酶通常用作完整线粒体存在的定量酶标记物。 柠檬酸合酶的xxx活性表明骨骼肌的线粒体含量。 xxx活动量可以通过耐力训练或高强度间歇训练来增加，但xxx活动量会随着高强度间歇训练而进一步增加。

柠檬酸合成酶催化乙酰辅酶A的二碳乙酸残基与一分子四碳草酰乙酸缩合生成六碳柠檬酸：

• 乙酰辅酶 A + 草酰乙酸 + H2O → 柠檬酸盐 + CoA-SH

• 乙酰辅酶A
• 草酰乙酸
• 柠檬酸

草酰乙酸在完成一轮克雷布斯循环后再生。

草酰乙酸是xxx个与酶结合的底物。 这会诱导酶改变其构象，并为乙酰辅酶 A 创建一个结合位点。 只有当这种柠檬酰辅酶 A 形成时，另一个构象变化才会导致硫酯水解并释放辅酶 A。这确保了硫酯键裂解释放的能量将驱动缩合。

柠檬酸合成酶的 437 个氨基酸残基被组织成两个主要亚基，每个亚基由 20 个 α-螺旋组成。 这些 alpha 螺旋构成了大约 75% 的柠檬酸合酶的三级结构，而其余残基主要构成结构的不规则延伸，除了 13 个残基的单个 β-折叠。 在这两个亚基之间，存在一个包含活性位点的裂缝。 其中有两个结合位点：一个为柠檬酸盐或草酰乙酸保留，另一个为辅酶 A。活性位点包含三个关键残基：His274、His320 和 Asp375，它们在与底物的相互作用中具有高度选择性。相邻图像显示 柠檬酸合酶的打开和关闭形式的三级结构。 添加一种底物（例如草酰乙酸）后，酶会从打开状态变为关闭状态。

柠檬酸合成酶在其活性位点（称为催化三联体）具有三个关键氨基酸，可催化乙酰辅酶 A [H3CC(=O)−SCoA] 和草酰乙酸 [−O2CCH2C(=O)CO2−] 转化为 羟醛缩合反应中的柠檬酸盐 [−O2CCH2C(OH)(CO2−)CH2CO2−] 和 H−SCoA。 这种转化开始于 Asp-375 的带负电荷的羧酸侧链氧原子去质子化乙酰辅酶 A 的 α 碳原子以形成烯醇阴离子，该阴离子又被 His-274 质子化中和以形成烯醇中间体 [H2C=C (OH)−SCoA]。 此时，最后一步形成的 His-274 上的 epsilon 氮孤对电子提取羟基烯醇质子，重新形成烯醇阴离子，对草酰乙酸的羰基碳 [−O2CCH2C(=O) 发起亲核攻击 CO2−] 进而使 His-320 的 epsilon 氮原子去质子化。 这种亲核加成导致柠檬酰辅酶 A [−O2CCH2CH(CO2−)CH2C(=O)−SCoA] 的形成。

此时，水分子被 His-320 的 epsilon 氮原子去质子化并开始水解。 其中一个氧的孤对亲核攻击柠檬酰辅酶 A 的羰基碳。 这形成了一个四面体中间体，并导致-SCoA 在羰基重组时被排出。 -SCoA 被质子化形成 HSCoA。 最后，在上一步中添加到羰基上的羟基被去质子化，形成柠檬酸盐 [−O2CCH2C(OH)(CO2−)CH2CO2−]。

该酶被高比例的 ATP:ADP 和 NADH:NAD 抑制，因为高浓度的 ATP 和 NADH 表明细胞的能量供应很高。 它也被琥珀酰辅酶 A 和丙酰辅酶 A 抑制，类似于乙酰辅酶 A，作为乙酰辅酶 A 的竞争性抑制剂和草酰乙酸的非竞争性抑制剂。 柠檬酸盐抑制该反应，是产物抑制的一个例子。乙酰辅酶 A 类似物对柠檬酸合酶的抑制也已得到充分证明，并已被用来证明单一活性位点的存在。 这些实验表明，该单个位点在两种形式之间交替，分别参与连接酶和水解酶活性。