酵母菌双杂合系统

发酵母菌双杂合系统（最初称为酵母双杂交系统或 Y2H）是一种分子生物学技术，用于通过测试两者之间的物理相互作用（例如结合）来发现蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 和蛋白质-DNA 相互作用 蛋白质或单个蛋白质和 DNA 分子，分别。

测试背后的前提是通过转录因子与上游激活序列 (UAS) 的结合来激活下游报告基因。 对于双杂交筛选，转录因子被分成两个独立的片段，称为 DNA 结合域（DBD 或通常也缩写为 BD）和激活域 (AD)。 BD 是负责绑定到 UAS 的域，AD 是负责转录激活的域。 因此，Y2H 是一种蛋白质片段互补测定。

最初设计用于使用酿酒酵母的 Gal4 转录激活因子检测蛋白质-蛋白质相互作用。 Gal4 蛋白激活参与半乳糖利用的基因的转录，这构成了选择的基础。 从那时起，相同的原理被用于描述许多替代方法，包括一些检测蛋白质-DNA 相互作用或 DNA-DNA 相互作用的方法，以及使用不同宿主生物（如大肠杆菌或哺乳动物细胞而不是酵母）的方法。

双杂交筛选的关键在于，在大多数真核转录因子中，激活域和结合域是模块化的，并且可以在彼此接近的情况下发挥作用而无需直接结合。 这意味着即使转录因子被分裂成两个片段，当两个片段间接连接时它仍然可以激活转录。

最常见的筛选方法是酵母双杂交试验。 在这种方法中，研究人员知道每个猎物在所用培养基（琼脂平板）上的位置。 在最近十年中，使用高通量筛选系统（通常使用机器人）筛选了数百万种生物体中的潜在相互作用，并且已经检测到数以千计的相互作用并在数据库中归类为 BioGRID。 该系统通常使用基因工程酵母菌株，其中缺乏某些营养素（通常是氨基酸或核酸）的生物合成。 当在缺乏这些营养素的培养基上生长时，酵母无法存活。 可以使这种突变酵母菌株掺入质粒形式的外源 DNA。 在酵母双杂交筛选中，将单独的诱饵和猎物质粒同时引入突变酵母菌株或使用交配策略在一个宿主细胞中获得两种质粒。

第二种高通量方法是文库筛选方法。 在这个设置中，诱饵和猎物窝藏细胞以随机顺序交配。 在选择性培养基上交配和选择存活细胞后，科学家将对分离的质粒进行测序，以查看哪个猎物（DNA 序列）与使用的诱饵相互作用。 与矩阵方法相比，这种方法的重现率较低，并且往往会产生更多的误报。

质粒被改造以产生一种蛋白质产物，其中 DNA 结合域 (BD) 片段融合到一种蛋白质上，而另一种质粒被改造以产生一种蛋白质产物，其中激活域 (AD) 片段融合到另一种蛋白质上。 与 BD 融合的蛋白质可称为诱饵蛋白，通常是研究人员用来识别新结合伙伴的已知蛋白质。 与 AD 融合的蛋白质可称为猎物蛋白，可以是单一的已知蛋白质，也可以是已知或未知蛋白质的文库。 在这种情况下，文库可能由代表特定生物体或组织中表达的所有蛋白质的蛋白质编码序列的集合组成，或者可能通过合成随机 DNA 序列生成。

无论来源如何，它们随后都被整合到质粒的蛋白质编码序列中，然后将质粒转染到选择用于筛选方法的细胞中。 当使用文库时，该技术假定每个细胞只用一个质粒转染，因此每个细胞最终只表达蛋白质文库中的一个成员。

如果诱饵和猎物蛋白相互作用（即结合），则转录因子的 AD 和 BD 间接连接，使 AD 接近转录起始位点，报告基因的转录就会发生。 如果这两种蛋白质不相互作用，报告基因就不会转录。 这样，融合蛋白之间的成功相互作用与细胞表型的变化有关。