单细胞测序

单细胞测序使用优化的下一代测序技术检查来自单个细胞的序列信息，提供更高分辨率的细胞差异并更好地了解单个细胞在其微环境中的功能。 例如，在癌症中，对单个细胞的 DNA 进行测序可以提供有关小细胞群携带的突变的信息。 在开发过程中，对单个细胞表达的 RNA 进行测序可以深入了解不同细胞类型的存在和行为。 在微生物系统中，同一物种的种群可能会出现遗传克隆。 尽管如此，RNA 的单细胞测序或表观遗传修饰可以揭示细胞间的变异性，这可能有助于种群快速适应在不断变化的环境中生存。

一个典型的人类细胞由大约 2 x 33 亿个碱基对的 DNA 和 6 亿个 mRNA 碱基组成。 通常，使用 Sanger 测序或 Illumina 测序等传统方法对 DNA 或 RNA 进行测序时，会混合使用数百万个细胞。 通过对单个细胞的 DNA 和 RNA 进行深度测序，可以广泛研究细胞功能。 与典型的下一代测序实验一样，单细胞测序方案一般包含以下步骤：单细胞分离、核酸提取和扩增、测序文库制备、测序和生物信息学数据分析。 进行单细胞测序比对大量细胞进行测序更具挑战性。 来自单个细胞的最少量起始材料会导致降解、样品损失和污染对测序数据的质量产生显着影响。 此外，由于所用核酸数量为皮克级，单细胞测序的样品制备过程中往往需要大量扩增，导致测序数据覆盖不均、噪声大、定量不准确。

最近的技术改进使单细胞测序成为解决一组看似无法解决的问题的有前途的工具。 例如，异质样本、稀有细胞类型、细胞谱系关系、体细胞组织嵌合体、无法培养的微生物分析以及疾病演变都可以通过单细胞测序来阐明。 单细胞测序被自然出版集团选为2013年的方法。

单细胞 DNA 基因组测序涉及分离单个细胞，扩增整个基因组或感兴趣区域，构建测序文库，然后应用下一代 DNA 测序（例如 Illumina、Ion Torrent、MGI）。 单细胞 DNA 测序已广泛应用于哺乳动物系统以研究正常生理和疾病。 单细胞分辨率可以揭示遗传嵌合体或肿瘤内遗传异质性在癌症发展或治疗反应中的作用。 在微生物组的背景下，来自单个单细胞生物的基因组被称为单个扩增基因组 (SAG)。 单细胞 DNA 测序的进步使得能够从复杂微生物组中存在的未培养原核物种中收集基因组数据。 尽管 SAG 具有低完整性和显着偏差的特点，但最近的计算进步已经实现了从复合 SAG 组装近乎完整的基因组。 从微生物中获得的数据可能会建立未来的培养过程。 单细胞单细胞分析中使用的一些基因组组装工具包括 SPAdes、IDBA-UD、Cortex 和 HyDA。

已经发布了 100 多种不同的单细胞组学方法的列表。

多重置换扩增 (MDA) 是一种广泛使用的技术，能够将飞克级的 DNA 从细菌扩增到微克级以进行测序。 MDA 反应所需的试剂包括：随机引物和来自噬菌体 phi29 的 DNA 聚合酶。 在 30 度等温反应中，使用附带的试剂扩增 DNA。

当聚合酶制造新链时，会发生链置换反应，从每个模板 DNA 合成多个拷贝。 同时，先前延伸的链将被置换。 MDA 产品的长度约为 12 kb，范围可达 100 kb 左右，使其可用于 DNA 测序。 2017 年，通过利用 phi29 聚合酶的耐热突变体，对这项技术进行了重大改进，称为 WGA-X，从而更好地从单个细胞中恢复基因组，尤其是那些具有高 G+C 含量的细胞。 MDA 也已在基于微流体液滴的系统中实施，以实现高度并行的单细胞全基因组扩增。 通过将单细胞封装在液滴中进行 DNA 捕获和扩增，与传统的 MDA 相比，该方法可减少偏差并提高通量。