高分辨率熔解

高分率熔解 (HRM) 分析是分子生物学中一项强大的技术，用于检测双链 DNA 样本中的突变、多态性和表观遗传差异。 它是由爱达荷科技公司和犹他大学发现和开发的。 与其他基因分型技术相比，它具有优势，即：

• 与测序和 TaqMan SNP 分型等其他基因分型技术相比，它具有成本效益。 这使其成为大规模基因分型项目的理想选择。
• 它快速而强大，因此能够快速准确地对许多样本进行基因分型。
• 很简单。 借助高质量的 HRM 检测，非遗传学家可以在任何实验室使用具有 HRM 功能的实时 PCR 机器进行强大的基因分型。

HRM 分析是在双链 DNA 样本上进行的。 通常，用户会在 HRM 分析之前使用聚合酶链式反应 (PCR) 来扩增他们感兴趣的突变所在的 DNA 区域。 在样本管中，现在有许多感兴趣的 DNA 区域的拷贝。 这个被放大的区域被称为扩增子。在 PCR 过程之后，HRM 分析开始。 该过程只是将扩增子 DNA 从大约 50 ˚C 精确加热到大约 95 ˚C。 在此过程中的某个时刻，达到扩增子的解链温度，两条 DNA 链分离或解链。

HRM 的关键是实时监控这种链分离。 这是通过使用荧光染料实现的。 用于 HRM 的染料被称为嵌入染料，具有独特的特性。 它们与双链 DNA 特异性结合，当它们结合时会发出明亮的荧光。 在没有双链 DNA 的情况下，它们无法结合，只能发出低水平的荧光。 在 HRM 分析开始时，由于扩增子有数十亿个拷贝，样品中会发出高水平的荧光。 但随着样品被加热，两条 DNA 链解开，双链 DNA 的存在减少，因此荧光减弱。 HRM 机器有一个摄像头，通过测量荧光来观察这个过程。 然后机器简单地将这些数据绘制成称为熔解曲线的图表，显示荧光水平与温度的关系：

两条 DNA 链分开时扩增子的解链温度是完全可以预测的。 它取决于 DNA 碱基的序列。 如果您比较来自两个不同人的两个样本，他们应该给出完全相同形状的熔解曲线。 但是，如果一个人在您扩增的 DNA 区域发生突变，那么这将改变 DNA 链解链的温度。 所以现在两条熔解曲线看起来不同了。 差异可能很小，可能只有几分之一度，但由于 HRM 机器能够以高分辨率监控此过程，因此可以准确记录这些变化，从而确定是否存在突变。

事情变得比这稍微复杂一些，因为生物体包含每个基因的两个（或更多）拷贝，称为两个等位基因。 因此，如果从患者身上采集样本并使用 PCR 进行扩增，则感兴趣的 DNA（等位基因）区域的两个拷贝都会被扩增。 所以如果我们正在寻找突变，现在有三种可能性：

• 两个等位基因都不包含突变
• 一个或其他等位基因包含突变
• 两个等位基因都包含一个突变。

这三种情况分别称为野生型、杂合子或纯合子。 每个都给出了略有不同的熔解曲线。 通过高质量的 HRM 分析，可以区分所有这三种情况。

纯合等位基因变体的特征可以是 HRM 分析产生的所得熔解曲线上的温度偏移。 相比之下，杂合子的特征在于熔解曲线形状的变化。 这是由于野生型和变异链之间不稳定的异源双链退火产生的碱基对错配。 在生成的熔解曲线上可以很容易地看到这些差异，并且可以通过生成差异曲线直观地放大不同基因型之间的熔解曲线差异。

传统的 SNP 分型方法通常既费时又昂贵，需要将多个基于探针的检测方法多重在一起或使用 DNA 微阵列。 HRM 更具成本效益，减少了设计多对引物和购买昂贵探针的需要。 HRM 方法已成功用于检测基因 Vssc（电压敏感钠通道）中单个 G 到 A 的取代，该取代赋予对 ac 的抗性。