荧光显微镜

荧光显微镜，是从生物或非生物样品荧光 - 磷光通过观察现象，观察目标显微镜是。有时会同时观察到反射光或透射光图像。用于生物学 / 医学研究，临床测试和渗透测试。

普通光学显微镜，但做观察的光源如钨卤素灯，用于观察与荧光的样品的荧光显微镜超高压水银灯和氙灯、紫外线LED、激光通过使用荧光它可以在材料的激发波长下进行照明。

激发光的紫外线邻近如（UV激发·334 / 365nm）下·蓝色光（B激发·435分之405/ 490nm处）·绿色光（G激发·546纳米）被使用。通常使用超高压汞灯作为激发光源。这是因为可以进行紫外线的激发。由于其工作原理，超高压水银灯需要专用的高压电源，并且还需要定期更换水银灯泡。因此，近年来，以小型化和易于维护为目的，开发了使用紫外线LED的产品。

在使用紫外线的情况下，可能会对人体造成不良影响，因此，通过在紫外线的散射部位附近设置紫外线截止滤光片，可以保护人体。超高压水银灯发出的光含有UV-C，对人体特别有害。

在结构上，它大致分为透射型荧光显微镜和落射照明型荧光显微镜。透射荧光显微镜具有更简单的结构并且具有悠久的历史，但是如今，由于技术上的创新，主要使用了具有许多改进性能的余辉荧光显微镜。

• 与普通光学显微镜（生物显微镜）一样，从下方照射激发光。此时，在光源上安装滤光片（激发滤光片），仅照射激发光的波长。
• 使用暗场聚光器以激发光照射样品制备
• 只有样品产生的荧光和样品散射的激发光才能到达目镜。
• 使用仅透射目标荧光波长的滤光器（吸收滤光器），仅提取荧光。
• 观察荧光

• 以落射照明（同轴照明）照射激发光。二向色镜用作落射照明的反射镜（可以将激发滤光片用作辅助镜），并且仅以激发光的波长照射样品。
• 只有样品产生的荧光和样品散射的激发光才能到达目镜。
• 使用仅透射所需荧光波长的吸收滤光片仅提取荧光。
• 观察荧光

透射荧光显微镜结构简单且价格便宜，但是增加激发光的强度是有局限的，不能与相衬观察相结合，厚样品在目镜侧产生荧光。现在，落射照明荧光显微镜已经成为主流，因为相关的光学技术由于其制造难度而进行了革新。通过更改光源，某些显微镜与透射和落射照明观察方法兼容。

原理用紫外线穿过物镜的激励光，以执行激励具有紫外线的高透光率，由透镜材料的荧光的产生（自发荧光，下同）以下的物镜是必要的。为此目的开发的物镜称为Fluor（荧光剂/荧光剂，在德语中是指萤石）。

作为用于荧光观察的特殊染色方法，进行荧光染色、化学荧光染色、抗体荧光染色等。

在荧光染色中，使用对各细胞器，pH / 离子等具有高染色特异性的荧光染料进行荧光染色。在某些情况下，使用多种荧光染料并对每个器官染色（多次染色）。作为荧光染料，使用DAPI，若丹明，荧光素和相关化合物。除化学物质外，还根据颗粒大小使用具有各种荧光特性的量子点进行染色。

在抗体荧光染色中，使用抗原-抗体反应，并且将用荧光染料标记的抗体（荧光标记）掺入样品中并进行染色。由于可以对抗原物质进行高特异性染色，因此可用于临床检查。

如果要照射的激发光的强度太高，这些荧光染料可能会褪色。因此，采取诸如降低激发光的强度或添加抗褪色剂的措施。

在化学荧光染色中，将样品用试剂处理以转化为荧光物质，并观察荧光部分。

另一种方法是引入通过遗传重组诱导诸如绿色荧光蛋白（GFP）的荧光蛋白的基因，并对其进行观察。（这在报告基因中有详细说明）

样品产生的荧光通常对激发光非常微弱，因此有必要使观察位置变暗以提高信噪比。近年来，通过使用诸如冷却的CCD照相机的观察装置进行长时间曝光和观察极弱的荧光的图像处理，可以获得高分辨率和对比度。

根据样品的不同，荧光可能会从要观察的部位以外的地方产生，这可能会变成背景噪音并干扰观察。这种现象称为“自发荧光”。在生物样品中特别成问题的包括叶绿素 b、胶原蛋白、原纤蛋白、黄素、吲哚胺、NADH、NADPH、多酚、色氨酸等。为了消除该现象，可以采用化学去除目标物质或在该物质不发荧光的波长下进行激发的方法。

除了样品中混入的物质外，载玻片、盖玻、浸油的油以及显微镜中使用的透镜材料也可能引起自发荧光。使用荧光弱的样品时，需要使用低荧光玻璃的载玻片/盖玻片。

共聚焦激光显微镜是可以通过用具有激发波长的激光进行多阶段扫描照射并合成所获得的荧光来获得非常深的景深的显微镜。结果，可以观察到样品的三维结构。

全内反射荧光显微镜是渐逝场使用进行局部激励，也能够浅场的非常深度。在某些情况下，可以观察到单个荧光分子的行为，从而促进了单分子细胞生物学和生理学的发展。