克隆

克隆是通过自然或人工手段生产具有相同或几乎相同 DNA 的个体生物的过程。 在自然界中，一些生物通过无性繁殖产生克隆。 在生物技术领域，克隆是创建细胞和 DNA 片段（分子克隆）的克隆生物体（副本）的过程。

克隆是一种自然的繁殖方式，它让生命形式传播了数亿年。 它是植物、真菌和细菌使用的一种繁殖方法，也是克隆菌落自我繁殖的方式。 这些生物体的例子包括蓝莓植物、榛树、潘多树、肯塔基咖啡树、杨梅和美洲枫香。

分子克隆是指制造多个分子的过程。 克隆通常用于扩增包含完整基因的DNA片段，但它也可用于扩增任何DNA序列，如启动子、非编码序列和随机片段化的DNA。 它被广泛用于从遗传指纹识别到大规模蛋白质生产的各种生物实验和实际应用中。 有时，术语克隆被误导性地用于指代与感兴趣的特定表型相关的基因的染色体位置的鉴定，例如定位克隆。实际上，将基因定位到染色体或基因组区域并不一定能够分离或扩增相关的基因组序列。要在活生物体中扩增任何 DNA 序列，该序列必须与复制起点相关联，复制起点是能够指导自身和任何相关序列繁殖的 DNA 序列。然而，还需要许多其他功能，并且存在各种专门的克隆载体（可以插入外来 DNA 片段的小 DNA 片段），它们允许蛋白质生产、亲和标记、单链 RNA 或 DNA 生产以及其他分子生物学工具的主机。

任何DNA片段的克隆基本上都涉及四个步骤

• 片段化——分解一条 DNA 链
• 连接——将 DNA 片段按所需序列粘合在一起
• 转染——将新形成的 DNA 片段插入细胞
• 筛选/选择——选出成功转染新 DNA 的细胞

虽然这些步骤在克隆过程中是不变的，但可以选择许多替代途径；这些被概括为克隆策略。

最初，需要分离感兴趣的 DNA 以提供合适大小的 DNA 片段。 随后，使用连接程序将扩增片段插入载体（DNA 片段）。使用限制酶将载体（通常是环状的）线性化，并在适当的条件下用称为 DNA 连接酶的酶与感兴趣的片段一起孵育。连接后，将带有感兴趣插入片段的载体转染到细胞中。有许多可供选择的技术，例如细胞化学敏化、电穿孔、光学注射和基因枪。

最后，培养转染的细胞。由于上述程序的效率特别低，因此需要鉴定已成功转染含有按所需方向插入所需序列的载体构建体的细胞。现代克隆载体包括可选择的抗生素抗性标记，仅允许已转染载体的细胞生长。

此外，克隆载体可能包含颜色选择标记，可在 X-gal 培养基上提供蓝/白筛选（α 因子互补）。 然而，这些选择步骤并不能绝 对保证所获得的细胞中存在 DNA 插入片段。 必须对产生的菌落进行进一步调查，以确认克隆是否成功。 这可以通过 PCR、限制性片段分析和/或 DNA 测序来完成。

克隆一个细胞意味着从一个细胞中衍生出一群细胞。 对于单细胞生物，如细菌和酵母，这个过程非常简单，基本上只需要接种适当的培养基。