全内反射荧光显微镜

全内反射荧光显微镜 (TIRFM) 是一种显微镜，可以观察样品的薄区域，通常小于 200 纳米。

TIRFM 是一种成像模式，它在载玻片上支撑的薄光学样品切片中使用荧光细胞的激发。 该技术基于以下原理：当激发光在透明固体盖玻片与液体介质的界面处发生全内反射时，在固-液界面处会产生电磁场，也称为倏逝波 频率作为激发光。 渐逝波的强度随与固体表面的距离呈指数衰减，因此只有在固体的几百纳米范围内的荧光分子才能被有效激发。 然后可以获得荧光的二维图像，尽管也有一些机制可以获得关于囊泡或结构在细胞中的位置的三维信息。

宽场荧光于 1910 年推出，这是一种光学技术，可以照亮整个样品，如图 1 所示。随后，共聚焦显微镜于 1960 年推出，它通过将光导向精确点并照亮光锥来减少样品的背景和曝光时间 进入样本。 在 20 世纪 80 年代，TIRFM 的引入通过仅照亮被检查样品的薄部分进一步减少了背景和曝光时间。

有两种常见的方法可以为 TIRFM 产生倏逝波。 xxx种是棱镜方法，它使用棱镜以足以引起全内反射的入射角将激光引向盖玻片和介质/细胞之间的界面。 这种配置已应用于细胞显微镜 30 多年，但由于一些限制从未成为主流工具。 尽管棱镜配置有许多变化，但大多数都限制了对标本的访问，这使得难以执行操作、将介质注入标本空间或进行生理测量。 另一个缺点是，在大多数基于倒置显微镜设计的配置中，照明是在物镜光学元件相对的样品侧引入的，这需要通过大量样品对消逝场区域进行成像。 对这个系统进行成像需要很大的复杂性和精确性，这意味着棱镜方法并没有被许多生物学家使用，而是仅限于物理学家使用。

另一种方法被称为物镜法，它增加了 TIRFM 在细胞显微镜中的使用，并且自商业解决方案可用以来进一步增加。 在这种机制中，通过改变物镜后焦平面上光束焦点的离轴位置，可以轻松地在标准宽场荧光和 TIRF 之间切换。 有几种开发的方法可以改变光束的位置，例如使用可以改变与连接到显微镜的荧光照明器相关的位置的致动器。

在细胞和分子生物学中，已经使用传统荧光显微镜研究了细胞表面的大量分子事件，例如细胞粘附、激素对细胞的结合、神经递质的分泌和膜动力学。 然而，与样品表面结合的荧光团和周围介质中的荧光团以平衡状态存在。 当这些分子被激发并用传统的荧光显微镜检测时，由于非结合分子的数量要多得多，结合到表面的那些荧光团产生的荧光通常会被背景荧光淹没。 TIRFM 允许选择性激发表面结合的荧光团，而未结合的分子不会被激发，也不会发出荧光。 由于亚微米表面选择性，TIRFM 已成为单分子检测的首选方法。

TIRFM 在细胞显微镜中有许多应用。 其中一些应用程序包括：

• 测量响应配体结合和受体运动的受体内吞作用的动力学
• 通过用荧光染料加载经历胞吐作用的囊泡来观察胞吐事件
• 定性和定量地描述不同蛋白质在胞吐/胞吞中的作用
• 观察细胞与固体基质之间接触区域的大小、运动和距离

由于能够光学解析单个囊泡并直接跟踪它们相互作用的动力学，TIRFM 提供了以某种方式研究参与神经生物学过程的大量蛋白质的能力。