蓝/白筛

蓝/白筛是一种基因工程方法，用于识别包含转基因的细菌克隆。

蓝/白筛的目标是鉴定具有所需修饰的转基因细菌。 一方面，鉴定出那些已经吸收了质粒（通常是克隆载体）的细菌，另一方面，蓝/白筛回答了质粒是否被成功修饰的问题。 为了确定含有质粒的细菌，质粒携带一个基因，该基因赋予所用细菌菌株尚不具备的抗生素抗性。 如果细菌在含有适当抗生素的培养基上培养，理想情况下只有那些接受了质粒的细菌才能在那里存活。

某些质粒用作蓝/白筛的载体，其在将转基因插入质粒的位置（多克隆位点）包含 β-半乳糖苷酶基因（lacZ 基因）。 半乳糖苷酶基因用作报告基因。

通过将转基因插入多克隆位点，半乳糖苷酶失活。 因此，在转化质粒后，如果用于转化的细菌菌株不含有任何其他半乳糖苷酶基因，则与非转基因生物相比，转基因生物不含有任何功能性半乳糖苷酶。 为此使用了特殊的突变菌株，它们含有抑制功能性半乳糖苷酶表达的突变。 半乳糖苷酶的 lacZΔM15 突变体缺失了 11 到 41 位氨基酸，这意味着半乳糖苷酶不能再形成同源四聚体，即半乳糖苷酶的酶促活性形式。 然而，半乳糖苷酶（与 ω 肽同义）的 lacZΔM15 突变体可以通过半乳糖苷酶（α 肽）的氨基酸 1 至 59 的蛋白质补充成功能形式，在这种情况下其基因位于质粒上.

半乳糖苷酶是一种糖苷酶，可以将黄色染料 XGal 分解成蓝色染料和半乳糖。 半乳糖苷酶的 lacZ 基因由启动子控制，其中基因表达由诱导剂启动，因为 Lac 阻遏物 LacI 将诱导剂与基因结合以释放基因表达。 当在培养基中使用 XGal 时，在细菌中含有的半乳糖苷酶诱导后约一小时会出现蓝色。 另一方面，在转基因生物体中，半乳糖苷酶失活，这意味着它们的菌落保持未染色，并且可以根据它们没有染色来分离它们。 由于通过乳糖通透酶（lacY 基因）导入乳糖会被葡萄糖抑制，因此培养基不应含有任何葡萄糖。

并非每个白色菌落都是转基因生物，并且并非每个转基因生物都包含要克隆的所需基因，但包含其他 DNA 片段。 如果使用太少的抗生素或太旧的培养基来选择质粒的抗性基因，则没有质粒的白色菌落也会生长。 由于这些原因，进行了进一步的分析，例如 B. 通过聚合酶链式反应（主要是菌落聚合酶链式反应）或通过限制性消化的 DNA 提取，随后进行琼脂糖凝胶电泳。 XGal 对光敏感，因此染色剂本身和含有 XGal 的琼脂平板均需避光保存。