蛋白质剪接

蛋白质剪接是特定蛋白质的分子内反应，其中从前体蛋白质中去除内部蛋白质片段（称为内含肽），并在两侧连接C端和N端外部蛋白质（称为内含肽）。前体蛋白的剪接点主要是半胱氨酸或丝氨酸，它们是含有亲核侧链的氨基酸。现在已知的蛋白质剪接反应不需要外源性辅助因子或能源，如三磷酸腺苷(ATP)或三磷酸鸟苷(GTP)。通常，剪接仅与前体mRNA剪接相关。这种前体蛋白包含三个片段——一个N-extein，然后是intein，然后是一个C-extein。剪接发生后，产生的蛋白质含有与C-extein相连的N-extein；这种剪接产物也称为外显子。

xxx个内含肽是在1988年通过粗糙脉孢菌和胡萝卜液泡ATP酶（不含内含肽）与酵母中的同源基因（含内含肽）之间的序列比较而发现的，该基因最初被描述为推定的钙离子转运蛋白。1990年Hirata等人。证明酵母基因中的额外序列被转录成mRNA并仅在翻译后从宿主蛋白质中去除。从那时起，在生命的所有三个领域（真核生物、细菌和古细菌）和病毒中都发现了内含肽。

蛋白质剪接是出乎意料的，1990年两个小组（Anraku和Stevens）发现了其机制。他们都在液泡H+-ATPase酶的前体中发现了酿酒酵母VMA1。N-和C-末端的氨基酸序列对应于来自其他生物的液泡H+-ATPase的70%DNA序列，而中央位置的氨基酸序列对应于总DNA序列的30%在酵母HO核酸酶。

许多基因在不同位置插入了不相关的内含肽编码片段。由于这些和其他原因，内含肽（或更恰当地说，编码内含肽的基因片段）有时被称为自私的遗传元件，但称它们为寄生的可能更准确。根据以基因为中心的进化观点，大多数基因只是在与其他基因或等位基因竞争方面是“自私的”，但通常它们为生物体发挥作用，而“寄生遗传元件”，至少在最初，不会产生对机体的适应性做出积极贡献。

在所有已知内含肽()的数据库中，113种已知内含肽存在于真核生物中，最小长度为138个氨基酸，xxx长度为844个氨基酸。发现xxx个内含肽编码在酿酒酵母的VMA基因中。后来在真菌（子囊菌、担子菌、接合菌和壶菌）和多种蛋白质中也发现了它们。一种与已知含有内含肽的蛋白质远亲但与后生动物刺猬蛋白密切相关的蛋白质已被描述为具有来自球藻门的内含肽序列。许多新描述的内含肽含有归巢核酸内切酶，其中一些显然是有活性的。真菌中内含肽的丰度表明横向转移含内含肽的基因。在真细菌和古细菌中，目前已知的内含肽有289种和182种。毫不奇怪，真细菌和古细菌中的大多数内含肽被发现插入核酸代谢蛋白中，如真菌。

内含肽在蛋白质剪接方面非常有效，因此它们在生物技术中发挥了重要作用。迄今已鉴定出200多个内含肽；大小范围为100–800AA。Inteins已被设计用于特定应用，例如蛋白质半合成和蛋白质片段的选择性标记，这对于大蛋白质的NMR研究非常有用。

内含肽切除的药物抑制可能是药物开发的有用工具；如果内含肽不切除，则含有内含肽的蛋白质将无法发挥其正常功能，因为其结构将被破坏。

有人提出，内含肽可用于实现某些通常由线粒体基因组编码的高度疏水性蛋白质的同种异位表达，例如在基因治疗中。这些蛋白质的疏水性是它们进入线粒体的障碍。因此，插入非疏水性内含肽可能允许这种导入继续进行。导入后切除内含肽将使蛋白质恢复为野生型。

亲和标签已被广泛用于纯化重组蛋白，因为它们允许积累很少杂质的重组蛋白。然而，亲和标签必须在最后的纯化步骤中被蛋白酶去除。额外的蛋白水解步骤在从重组蛋白中去除亲和标签以及去除消化产物时会产生蛋白酶特异性问题。通过在受控环境中将亲和标签融合到可自我切割的内含肽上，可以避免这个问题。xxx代此类表达载体使用了改良的酿酒酵母VMA(SceVMA)内含肽。冲等人。使用了来自环状芽孢杆菌的几丁质结合域(CBD)作为亲和标签，并将该标签与修改后的SceVMA内含蛋白融合。修饰的内含肽在其N端肽键处与1,4-二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇(β-ME)或胱氨酸在较宽的pH范围内低温下发生自裂解反应。重组蛋白表达后，细胞匀浆通过含有几丁质的柱子.这允许嵌合蛋白的CBD与柱子结合。此外，当温度降低且上述分子通过柱子时，嵌合蛋白进行自我剪接，仅洗脱目标蛋白。这种新技术消除了对蛋白水解步骤的需要，并且修饰的SceVMA保留在通过CBD连接到几丁质的柱子中。

最近，内含肽已被用于纯化基于自聚集肽的蛋白质。弹性蛋白样多肽(ELP)是生物技术中的有用工具。与目标蛋白融合后，它们往往会在细胞内形成聚集体。这消除了蛋白质纯化所需的色谱步骤。ELP标签已用于内含肽的融合蛋白，因此无需色谱法（通过离心）即可分离聚集体，然后内含肽和标签可以受控方式裂解，将目标蛋白释放到溶液中。这种蛋白质分离可以使用连续介质流完成，产生大量蛋白质，使该过程比传统方法更经济高效。另一组研究人员使用较小的自聚集标签来分离目标蛋白质。小两亲性肽18A和ELK16（图5）用于形成自切割聚集蛋白。