锌指核酸酶

锌指核酸酶 (ZFN) 是通过将锌指 DNA 结合结构域与 DNA 切割结构域融合而产生的人工限制酶。可以设计锌指结构域以靶向特定的所需 DNA 序列，这使锌指核酸酶能够靶向复杂基因组中的独特序列。

通过利用内源性 DNA 修复机制，这些试剂可用于精确改变高等生物的基因组。与 CRISPR/Cas9 和 TALEN 一起，ZFN 是基因组编辑领域的重要工具。

单个 ZFN 的 DNA 结合域通常包含 3 到 6 个单独的锌指重复序列，每个重复序列可识别 9 到 18 个碱基对。如果锌指结构域完美地识别 3 个碱基对的 DNA 序列，它们可以生成一个可以识别 9 个碱基对目标位点的 3 指阵列。

其他程序可以利用 1 指或 2 指模块来生成具有六个或更多独立锌指的锌指阵列。此过程的主要缺点是单个锌指的特异性可能重叠，并且可能取决于周围锌指和 DNA 的环境。

许多选择方法已被用于生成能够靶向所需序列的锌指阵列。最初的选择工作利用噬菌体展示从大量部分随机化的锌指阵列中选择结合给定 DNA 靶标的蛋白质。

最近的努力已经利用酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。一种选择新型锌指阵列的有前途的新方法利用细菌双杂交系统，并被其创造者称为 OPEN。

该系统结合了预先选择的单个锌指池，每个锌指被选择以结合给定的三联体，然后利用第二轮选择获得能够结合所需 9-bp 序列的 3 指阵列。

来自 IIs 限制性核酸内切酶 FokI 的非特异性切割域通常用作 ZFN 中的切割域。该切割结构域必须二聚化才能切割 DNA，因此需要一对 ZFN 来靶向非回文 DNA 位点。

标准 ZFN 将切割结构域融合到每个锌指结构域的 C 末端。为了让两个切割结构域二聚化并切割 DNA，两个单独的 ZFN 必须结合相反的 DNA 链，它们的 C 末端相隔一定距离。锌指结构域和切割结构域之间最常用的接头序列要求每个结合位点的 5' 边缘相隔 5 到 7 bp。

已采用几种不同的蛋白质工程技术来提高 ZFN 中使用的核酸酶结构域的活性和特异性。定向进化已被用于生成具有增强的切割活性的 FokI 变体，基于结构的设计也被用来通过修改二聚化界面来提高 FokI 的切割特异性，以便只有预期的异二聚体物种是活跃的。

指核酸钙可用于操纵许多植物和动物的基因组，包括拟南芥、烟草、大豆、玉米、黑腹果蝇、秀丽隐杆线虫、Platynereis dumerilii、海胆、蚕、斑马鱼、青蛙、小鼠、大鼠、兔子、 猪、牛和各种类型的哺乳动物细胞。

锌指核酸钙也被用于血友病小鼠模型，一项临床试验发现，带有被锌指核酸酶破坏的 CCR5 基因的 CD4+ 人类 T 细胞作为 HIV/AIDS 的潜在治疗方法是安全的。

ZFN 还用于创建称为同基因人类疾病模型的新一代遗传疾病模型。

ZFN 可用于通过在突变等位基因的 DNA 中产生双链断裂 (DSB)来禁用杂合子个体中的显性突变，在没有同源模板的情况下，该突变等位基因将被非同源模板修复 末端连接（NHEJ）。

NHEJ 通过将两端连接在一起来修复 DSB，并且通常不会产生突变，前提是切口干净且不复杂。然而，在某些情况下，修复是不完美的，导致碱基对的删除或插入，产生移码并阻止有害蛋白质的产生。多对 ZFN 也可用于完全去除基因组序列的整个大片段。