共聚焦显微镜

共聚焦显微镜，最常见的是共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或激光共聚焦扫描显微镜（LCSM），是一种光学成像技术，可通过使用空间针孔来阻挡散焦光来提高显微图像的光学分辨率和对比度。在图像形成中。捕获样品中不同深度的多个二维图像可重建三维结构（此过程称为光学切片）。该技术广泛用于科学和工业界，典型的应用是生命科学、半导体检查和材料科学。

光在常规显微镜下穿过样品，直到它可以穿透到样品为止，而共聚焦显微镜一次只能将一束较小的光束聚焦在一个狭窄的深度上。CLSM实现了受控且高度受限的景深。

共焦显微镜有四种类型：

共焦激光扫描显微镜使用多个反射镜（通常沿x轴和y轴线性扫描2或3个镜面）在样品上扫描激光，并在固定的针孔和检测器上“扫描”图像。

旋转圆盘（Nipkow圆盘）共聚焦显微镜使用圆盘上的一系列移动针孔来扫描光斑。由于一系列针孔平行扫描一个区域，因此与激光扫描显微镜相比，允许每个针孔悬停在特定区域上更长的时间，从而减少了照明样品所需的激发能。激发能的降低降低了样品的光毒性和光漂白，通常使其成为对活细胞或生物成像的首选系统。

微透镜增强或双旋转盘共聚焦显微镜的工作原理与旋转盘共聚焦显微镜相同，只是在包含针孔的旋转盘之前放置了第二个包含微透镜的旋转盘。每个针孔都有一个相关的微透镜。微透镜的作用是捕获较宽的光带并将其聚焦到每个针孔中，从而显着增加引导到每个针孔中的光量并减少旋转盘所阻挡的光量。因此，微透镜增强的共聚焦显微镜比标准的旋转盘系统具有更高的灵敏度。横河电机于1992年发明了这项技术。

可编程阵列显微镜（PAM）使用电控空间光调制器（SLM），该调制器会产生一组移动的针孔。SLM是一种包含像素阵列的设备，该像素阵列具有可以通过电子方式调整的单个像素的某些属性（不透明度，反射率或旋光度）。SLM包含微机电镜或液晶组件。该图像通常是通过电荷耦合器件（CCD）相机获取的。

这些共聚焦显微镜中的每一种都有特定的优点和缺点。大多数系统针对录制速度（即视频捕获）或高空间分辨率进行了优化。共焦激光扫描显微镜可以具有可编程的采样密度和非常高的分辨率，而Nipkow和PAM使用由相机分辨率定义的固定采样密度。单点激光扫描系统的成像帧速率通常比旋转磁盘或PAM系统慢。商业旋转盘共聚焦显微镜可实现每秒50帧以上的帧率–这是动态观察（例如活细胞成像）的理想功能。

实际上，只要针孔足够远，Nipkow和PAM允许多个针孔并行扫描同一区域。

通过使用多个微机电扫描镜，共聚焦激光扫描显微镜的前沿发展现在可以提供比标准视频速率（每秒60帧）更好的成像效果。

共焦X射线荧光成像是一种较新的技术，例如，在分析绘画中的掩埋层时，除了水平和垂直瞄准以外，还可以控制深度。

共聚焦显微镜是一种扫描成像技术，通过与其他扫描技术（如扫描电子显微镜SEM）进行比较，可以xxx地解释所获得的分辨率。CLSM的优点是，例如在AFM或STM中，不需要将探针从表面上悬垂纳米级，例如，通过在表面上用细小尖端进行扫描即可获得图像。从物镜到表面的距离（称为工作距离）通常可与常规光学显微镜相媲美。它随系统光学设计的不同而变化，但是典型的工作距离是几百微米到几毫米。

在共聚焦显微镜CLSM中，样品由点激光源照射，每个体积元素都与离散的散射或荧光强度相关。在此，扫描体积的大小由光学系统的光斑大小（接近衍射极限）决定，因为扫描激光的图像不是无限小的点而是三维衍射图案。此衍射图样的大小及其定义的焦点体积由数值孔径控制系统的物镜和所用激光的波长。这可以看作是使用广角照明的传统光学显微镜的经典分辨率极限。但是，通过共聚焦显微镜，甚至可以改善宽视场照明技术的分辨率极限，因为可以关闭共聚焦孔以消除更高阶的衍射图。例如，如果针孔直径设置为1艾里单位那么只有一阶衍射图样会通过孔径到达检测器，而更高的阶数会被遮挡，从而以稍微降低亮度的代价提高了分辨率。在荧光观察中，共聚焦显微镜的分辨率极限通常受信噪比限制由荧光显微镜中通常可用的少量光子引起的。可以通过使用更灵敏的光电探测器或通过增加照明激光点光源的强度来补偿这种影响。增加照明激光的强度可能会对目标样品造成过度漂白或其他损坏，特别是对于需要比较荧光亮度的实验。当对屈光不同的组织（例如植物叶片的海绵状叶肉或其他包含空气的组织）进行成像时，通常会损害共聚焦图像质量的球面像差。但是，通过将样品安装在光学透明，无毒的全氟化碳（如全氟萘烷）中，可以xxx降低此类像差容易渗入组织，其折射率几乎与水相同。

从细胞生物学和遗传学到微生物学和发育生物学，CLSM广泛用于众多生物科学学科。它也用于量子光学、纳米晶体成像和光谱学。

临床上，CLSM用于评估各种眼部疾病，并且特别适用于角膜内皮细胞的成像，定性分析和定量。用于角质化病的情况下，可以定位和识别角膜基质中丝状真菌元素的存在，从而能够快速诊断，从而尽早进行明确的治疗。研究激光共聚焦显微镜技术内窥镜程序（显微内镜）也呈现出承诺。在制药工业中，建议遵循薄膜药物剂型的制造过程，以控制药物分配的质量和均匀性。

CLSM在某些3D光学数据存储系统中用作数据检索机制，并有助于确定Magdalen纸莎草纸的年龄。

所述IRENE系统利用用于光学扫描和损坏的历史音频的恢复共焦显微镜的。