自动膜片钳

自动膜片钳正开始取代手动膜片钳作为测量单个细胞电活动的方法。不同的技术被用于自动化细胞培养和体内细胞的膜片钳记录。自1990年代后期以来，研究实验室和公司一直在进行这项工作，试图降低手动膜片钳的复杂性和成本。长期以来，膜片钳被认为是一种艺术形式，仍然非常耗时且乏味，尤其是在体内。自动化技术试图减少用户在从单细胞获取高质量电生理记录时的错误和可变性。

自动化技术因细胞周围环境而异。对于体内的细胞，这通常意味着细胞在大脑中并被其他细胞包围。这种环境还包含血管、树突、轴突和神经胶质细胞，它们通过堵塞直径为1-2μm的移液器尖端而更难形成gigaseal。在这里，如上所述，精确控制移液器尖端的压力和位置在防止堵塞和检测细胞是否靠近移液器尖端方面发挥着重要作用。

体外细胞可以悬浮在液体中，使其粘附在培养皿上，或者保留从动物身上取出的一块组织的一部分。由于动物的心跳或呼吸，这些环境通常不必补偿组织的运动。在细胞处于悬浮状态的情况下，移液器完全被一个带有孔的微芯片取代，该孔可以产生千兆密封并测量电活动。对于培养皿中的细胞或组织而言，堵塞问题也较小，因为可以通过显微镜看到细胞和移液器，这有助于技术人员避开除感兴趣细胞之外的所有物体。

这些自动化系统中的每一个都必须执行多项任务。它必须将细胞放置在移液器尖端或其他带有1-2μm孔的设备旁边，控制孔处的压力，并控制细胞内的电压。

Kodandaramaiah等人展示了体内膜片钳的一个例子。在这种情况下，压力控制由一组电子阀和电子压力调节器组成，以提供以前由技术人员提供的三种压力（高压800-1000mbar、低压20-30mbar和小真空15-150毫巴）。三个电子阀在三种压力和大气压之间切换。高压用于防止堵塞移液器，低压用于寻找细胞，真空用于帮助密封过程。这些都由计算机控制，随着移液管尖端阻力的变化，在压力中进行选择。

在这种情况下，手动位置控制被计算机控制的压电显微操纵器所取代，该微操纵器将移液器以离散的2-3μm步长移动到组织中，直到它与细胞接触。这种精确控制比手动定位更加准确和可重复，并且不需要操作员。

当移液器与细胞接触时，计算机还会计算和跟踪电阻的变化。它以方波的形式沿移液管向下发送电压信号，该信号从移液管末端流出或被细胞膜阻挡。当膜阻挡它时，计算机停止移液器的运动并施加吸力以形成千兆密封。这种自动化消除了技术人员必须执行的决策，并且与技术人员不同，计算机可以不知疲倦地以更高的精度执行这些任务。

所有这些步骤都按照与手动膜片钳相同的逻辑顺序执行，但不需要大量培训即可执行，并且完全由计算机控制。这减少了获得膜片钳记录所需的费用，并增加了在活脑中记录的可重复性和稳健性。

已经开发了许多类型的系统用于悬浮培养中的膜片钳细胞。一个系统使用传统的移液器和液滴悬浮培养中的细胞来获得膜片钳记录（见图）。这具有使用传统移液器制造系统的额外好处，该系统加热玻璃毛细管并将其纵向拉动以形成用于膜片钳的锥形尖端。

更常见的悬浮培养自动化系统使用在平面基板上带有微小(1-2μm)孔的微芯片而不是移液器来创建gigaseal并从单细胞记录。由于半导体行业开发的微细加工技术的改进，贴片芯片是在2000年代初期开发的。芯片通常由硅、玻璃、PDMS、聚酰亚胺制成。贴片芯片系统通常更复杂、更昂贵，但具有并行和免提操作的额外好处。

通常，神经元不会在悬浮培养中生长，但其他细胞类型可以。有些可以用基因转染以产生感兴趣的膜离子通道。这意味着通常没有电活动的细胞可以在其膜中生长离子通道，从而产生离子电流。由于细胞在悬浮培养中彼此分离，因此可以精确测量单个细胞中的离子电流。这使研究人员能够在不受其他细胞干扰的情况下研究离子通道行为在更受控的环境中，这通常发生在神经网络中。这在目标是特定蛋白质的药物筛选研究中特别有用。由于处理悬浮细胞比处理培养或体内细胞要容易得多，因此可以更快、更可靠地获得膜片钳记录，从而提高生产力，使筛选数千种化合物成为可能。

来自贴壁培养的干细胞的神经元可以被提升到悬浮液中，并已成功用于平面膜片钳装置。使用自动和手动膜片钳从这些细胞记录离子通道，例如电压门控钠通道、电压门控钾通道和配体GABA打开的离子型配体门控离子通道。

一种使用贴片芯片，如上面讨论的那些，以及导致培养细胞迁移到孔口的表面处理，这些孔在它们生长时形成gigaseal。通过让神经元在培养物中生长，它们自发地形成网络，就像大脑中的网络一样，它更像是天然组织，而不是悬浮的孤立细胞。

在另一种方法中，细胞从动物身上取出并在贴片芯片上培养2-4小时，因为它们会自发地与聚酰亚胺和PDMS贴片芯片形成gigaseals该系统不需要外部设备即可形成gigaseals。

另一种技术使膜片钳细胞在培养物中的定位自动化。它在精确的压电驱动平台上使用纳米吸管来扫描培养皿内的表面。当它扫描时，它通过上下移动移液器尖端和其下方的表面或细胞之间保持恒定的电容。（当它靠近细胞移动时，电容会增加，因此致动器将移液器移开，反之亦然。）这给出了培养皿内表面的精确地形图。在细胞被映射后，计算机将移液器移至选定的细胞并降低它以与它形成一个gigaseal。

另一种技术只是使仔细与细胞接触的业务自动化。操作员将移液器放在样品上，然后让自动化软件接管，降低移液器并试图检测移液器与细胞接触时阻力的增加。此时该过程结束，技术人员手动创建gigaseal。

膜片钳自动化仪器于2003年开始商业化。由于最初的高成本，这项近20年的技术最初旨在服务于生物技术和制药行业，但在过去几年中，它在学术界和非营利组织中的存在不断增长，鉴于其日益成熟的技术可靠性和成本的相对可及性。越来越多的大学和其他学术机构现在拥有配备膜片钳自动化设备的实验室和核心设施，这些设备与其他相关或互补的技术和方法相结合并共存。自动化膜片钳电生理学的接受和认可反映在发表的科学文献的指数增长中，并通过这种xxx性的新技术获得了结果。