电移位切试验

电泳迁移率变动分析 (EMSA) 或迁移率变动电泳，也称为凝胶迁移分析、凝胶迁移率变动分析、带迁移分析或凝胶阻滞分析，是一种常用的亲和电泳技术，用于研究蛋白质-DNA 或蛋白质- RNA相互作用。 此过程可以确定一种蛋白质或蛋白质混合物是否能够与给定的 DNA 或 RNA 序列结合，并且有时可以表明结合复合物中是否涉及多个蛋白质分子。 在研究转录起始、DNA 帮派复制、DNA 修复或 RNA 加工和成熟，以及 pre-mRNA 剪接时，凝胶迁移分析通常与 DNase 足迹、引物延伸和启动子探针实验同时进行。

迁移率变动分析是在聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶上对蛋白质-DNA 或蛋白质-RNA 混合物进行短时间电泳分离（对于 15 至 20 厘米的凝胶，大约需要 1.5-2 小时）。 不同分子（及其组合）在凝胶中移动的速度取决于它们的大小和电荷，在较小程度上取决于它们的形状（参见凝胶电泳）。 控制通道（不存在蛋白质的 DNA 探针）将包含与未结合的 DNA 或 RNA 片段相对应的单个条带。 然而，假设蛋白质能够与片段结合，存在结合蛋白质的泳道将包含另一个条带，代表与蛋白质结合的更大、流动性更小的核酸探针复合物，“向上移动” 凝胶（因为它移动得更慢）。

在正确的实验条件下，DNA（或 RNA）和蛋白质之间的相互作用是稳定的，凝胶上结合核酸与未结合核酸的比率反映了结合反应进入凝胶时游离和结合探针分子的比例。 这种稳定性部分是由于笼罩效应，因为被凝胶基质包围的蛋白质在重组前无法从探针扩散开。 如果蛋白质和探针的起始浓度已知，并且如果复合物的化学计量已知，则可以确定蛋白质对核酸序列的表观亲和力。 除非复合物在凝胶条件下寿命很长，或者考虑了电泳过程中的解离，否则得出的数字是表观 Kd。 如果蛋白质浓度未知但复杂的化学计量是已知的，则可以通过增加 DNA 探针的浓度来确定蛋白质浓度，直到进一步增加不会增加蛋白质结合的分数。 通过与在同一凝胶上运行的一组游离探针的标准稀释液进行比较，可以计算出蛋白质的摩尔数。

可以将识别蛋白质的抗体添加到该混合物中，以创建具有更大位移的更大的复合物。 这种方法称为超迁移分析，用于明确识别蛋白质-核酸复合物中存在的蛋白质。

通常，使用竞争性寡核苷酸运行额外的泳道以确定结合蛋白的最有利结合序列。 使用确定序列的不同寡核苷酸允许通过竞争识别精确的结合位点。 竞争测定的变体可用于测量结合的特异性以及测量缔合和解离动力学。 因此，EMSA 也可用作 SELEX 实验的一部分，以选择确实结合给定蛋白质的寡核苷酸。

一旦在体外确定了 DNA-蛋白质结合，许多算法可以缩小对转录因子鉴定的搜索范围。 感兴趣的转录因子的共有序列寡核苷酸将能够竞争结合，消除移位带，并且必须通过超移位确认。

如果预测的共有序列未能竞争结合，转录因子的鉴定可能会得到多路复用竞争 EMSA (MC-EMSA) 的帮助，从而在每个反应中多路复用大量共有序列，并且其中一组竞争结合， 来自该组的个别共有序列在进一步的反应中运行。

出于可视化目的，核酸片段通常用放射性、荧光或生物素标记进行标记。 标准溴化乙锭染色不如这些方法敏感，如果在这些实验中使用少量核酸或单链核酸，则可能缺乏检测核酸的灵敏度。 当使用生物素标记时，链霉亲和素与辣根过氧化物酶等酶结合用于检测 DNA 片段。