N连接糖基化

N-连接糖基化是一种寡糖，一种由几个糖分子组成的碳水化合物，有时也称为聚糖，在一个过程中连接到氮原子（蛋白质的天冬酰胺(Asn)残基的酰胺氮）称为N-糖基化，在生物化学中进行了研究。这种类型的连接对于许多真核蛋白质的结构和功能都很重要。N-连接的糖基化过程发生在真核生物中并广泛存在于古生菌中，但很少发生在细菌中。与糖蛋白连接的N连接聚糖的性质由蛋白质和表达它的细胞决定。它也因物种而异。不同的物种合成不同类型的N-连接聚糖。

糖蛋白中涉及两种类型的键：聚糖中糖残基之间的键以及聚糖链和蛋白质分子之间的键。糖部分通过糖苷键在聚糖链中相互连接。这些键通常在糖分子的碳1和4之间形成。糖苷键的形成在能量上是不利的，因此该反应与两个ATP分子的水解耦合。另一方面，聚糖残基与蛋白质的连接需要识别共有序列。N-连接聚糖几乎总是连接到天冬酰胺(Asn)侧链的氮原子上，该侧链作为Asn–X–Ser/Thr共有序列的一部分存在，其中X是除脯氨酸(Pro)之外的任何氨基酸。在动物细胞中，与天冬酰胺相连的聚糖几乎不可避免地是β构型的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)。这种β键类似于上述聚糖结构中糖部分之间的糖苷键。异头碳原子不是连接到糖羟基上，而是连接到酰胺氮上。这种连接所需的能量来自焦磷酸盐分子的水解。

N-连接聚糖的生物合成通过3个主要步骤进行：

• 多醇连接的前体寡糖的合成
• 前体寡糖向蛋白质的整体转移
• 寡糖的加工

前体寡糖的合成、整体转移和初始修整在内质网(ER)中发生。寡糖链的后续加工和修饰在高尔基体中进行。因此，糖蛋白的合成在不同的细胞区室中空间分离。因此，合成的N-聚糖的类型取决于其对这些细胞区室中存在的不同酶的可及性。然而，尽管存在多样性，但所有N-聚糖都是通过具有共同核心聚糖结构的共同途径合成的。核心聚糖结构基本上由两个N-乙酰氨基葡萄糖和三个甘露糖残基组成。然后对该核心聚糖进行进一步的加工和修饰，从而产生多种N-聚糖结构。

N-连接的糖基化过程从形成多醇连接的GlcNAc糖开始。Dolichol是由重复的异戊二烯单元组成的脂质分子。发现该分子附着在ER膜上。糖分子通过焦磷酸键连接到多糖醇上（一个磷酸盐最初与多糖醇相连，第二个磷酸盐来自核苷酸糖）。然后通过逐步添加各种糖分子使寡糖链延伸，形成前体寡糖。这种前体寡糖的组装发生在两个阶段：阶段I和阶段II。I期发生在ER的细胞质侧，II期发生在ER的腔侧。准备转移到蛋白质的前体分子由2个GlcNAc、9个甘露糖和3个葡萄糖分子组成。

一旦前体寡糖形成，完成的聚糖随后被转移到ER膜腔中的新生多肽。该反应是由多醇-聚糖分子之间的焦磷酸键断裂释放的能量驱动的。在将聚糖转移到新生多肽之前需要满足三个条件：

• 天冬酰胺必须位于一级结构中的特定共有序列（Asn-X-Ser或Asn-X-Thr或在极少数情况下为Asn-X-Cys）。
• 天冬酰胺必须适当地位于蛋白质的三维结构中（糖是极性分子，因此需要附着在位于蛋白质表面的天冬酰胺上，而不是埋在蛋白质内）
• 必须在内质网的管腔侧发现天冬酰胺，才能启动N-连接糖基化。靶残基要么存在于分泌蛋白中，要么存在于面向管腔的跨膜蛋白区域中。

寡糖基转移酶是负责识别共有序列并将前体聚糖转移至在内质网腔中翻译的多肽受体的酶。因此，N-连接糖基化是一个共翻译事件

N-聚糖加工在内质网和高尔基体中进行。前体分子的初始修整发生在ER中，随后的处理发生在高尔基体中。在将完成的聚糖转移到新生多肽上后，从结构中去除了两个葡萄糖残基。称为糖苷酶的酶会去除一些糖残基。这些酶可以通过使用水分子来破坏糖苷键。这些酶是外切糖苷酶，因为它们仅对位于聚糖非还原端的单糖残基起作用。这个初始修剪步骤被认为是ER中的质量控制步骤，以监测蛋白质折叠。一旦蛋白质正确折叠，葡萄糖苷酶I和II会去除两个葡萄糖残基。最后第三个葡萄糖残基的去除表明糖蛋白已准备好从ER转运至顺式高尔基体。ER甘露糖苷酶催化该最终葡萄糖的去除。然而，如果蛋白质没有正确折叠，葡萄糖残基就不会被去除，因此糖蛋白就不能离开内质网。伴侣蛋白（钙连接蛋白/钙网蛋白）与未折叠或部分折叠的蛋白质结合以帮助蛋白质折叠。下一步涉及进一步添加和去除顺式-高尔基体中的糖残基。这些修饰分别由糖基转移酶和糖苷酶催化。在cis-Golgi中，一系列甘露糖苷酶去除了α-1,2键中的四个甘露糖残基中的部分或全部。而在高尔基体的中间部分，糖基转移酶将糖残基添加到核心聚糖结构中，从而产生三种主要类型的聚糖：高甘露糖、杂合聚糖和复合聚糖。

• 本质上，高甘露糖只是两个具有许多甘露糖残基的N-乙酰氨基葡萄糖，通常几乎与前体寡糖中所见的数量一样多，然后才连接到蛋白质上。
• 复合寡糖之所以如此命名，是因为它们可以包含几乎任意数量的其他类型的糖类，包括比最初的两种N-乙酰氨基葡萄糖更多的糖类。
• 杂合寡糖在分支的一侧含有甘露糖残基，而在另一侧N-乙酰氨基葡糖引发复杂的分支。

向生长的聚糖链添加糖的顺序取决于酶的底物特异性以及它们在通过分泌途径移动时对底物的访问。因此，细胞内这种机制的组织在确定制造哪些聚糖方面起着重要作用。

高尔基酶在决定各种聚糖的合成中起关键作用。酶的作用顺序反映在它们在高尔基体中的位置：

在原核生物和古生菌中发现了类似的N-聚糖生物合成途径。然而，与真核生物相比，真细菌和古细菌中的最终聚糖结构似乎与内质网中产生的初始前体没有太大区别。在真核生物中，原始前体寡糖在到达细胞表面的途中被广泛修饰。

N-连接聚糖具有内在和外在功能。在免疫系统内，免疫细胞表面上的N-连接聚糖将有助于决定细胞的迁移模式，例如迁移到皮肤的免疫细胞具有有利于归巢到该位点的特定糖基化。各种免疫球蛋白（包括IgE、IgM、IgD、IgA和IgG）上的糖基化模式通过改变它们对Fc和其他免疫受体的亲和力赋予它们独特的效应功能。聚糖还可能参与自我和非自我歧视，这可能与各种自身免疫性疾病的病理生理学有关。在某些情况下，N-聚糖和蛋白质之间的相互作用通过复杂的电子效应使蛋白质稳定。

N-连接糖基化的变化与不同的疾病有关，包括类风湿性关节炎、1型糖尿病、克罗恩病和癌症。涉及N-连接糖基化的18个基因的突变导致多种疾病，其中大多数涉及神经系统。

市场上的许多治疗性蛋白质是抗体，它们是N-连接的糖蛋白。例如，依那西普、英夫利昔单抗和利妥昔单抗是N-糖基化治疗蛋白。N-连接糖基化的重要性在药物领域变得越来越明显。尽管细菌或酵母蛋白生产系统具有显着的潜在优势，例如高产量和低成本，但当感兴趣的蛋白质是糖蛋白时会出现问题。大多数原核表达系统如大肠杆菌不能进行翻译后修饰。另一方面，真核表达宿主，如酵母和动物细胞，具有不同的糖基化模式。这些表达宿主中产生的蛋白质通常与人类蛋白质不同，因此会引起患者的免疫原性反应。例如，酿酒酵母（酵母）经常产生具有免疫原性的高甘露糖聚糖。CHO或NS0细胞等非人哺乳动物表达系统具有添加复杂的人型聚糖所需的机制。然而，在这些系统中产生的聚糖可能与人类产生的聚糖不同，因为它们可以被N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)封端，而人类细胞仅产生含有N-乙酰神经氨酸的糖蛋白。此外，动物细胞还可以产生含有galactose-alpha-1,3-galactose表位的糖蛋白，这会在患有Alpha-gal过敏症的人中诱发严重的过敏反应，包括过敏性休克。这些缺点已通过多种方法得到解决，例如通过基因敲除消除产生这些聚糖结构的途径。此外，其他表达系统已经过基因工程以产生具有类人N连接聚糖的治疗性糖蛋白。这些包括酵母，如毕赤酵母、昆虫细胞系、绿色植物，甚至细菌。