冷冻保存

冷冻保存是通过冷却至极低温度（通常为-80_°C使用固态二氧化碳或-196°C使用液氮）。在足够低的温度下，任何酶或可能对所讨论的生物材料造成损害的化学活动被有效地阻止。冷冻保存方法力求达到低温，而不会因冷冻过程中冰晶的形成而造成额外的损害。传统的冷冻保存依赖于用一类称为冷冻保护剂的分子对要冷冻的材料进行涂层。由于许多冷冻保护剂的固有毒性，正在研究新方法。动物遗传资源的冷冻保存是为了保存品种。

水熊虫（Tardigrada）是一种微观的多细胞生物，可以通过用糖海藻糖代替大部分内部水而在冰冻中存活，从而防止其结晶，否则会损坏细胞膜.溶质的混合物可以达到类似的效果。包括盐在内的一些溶质的缺点是它们在高浓度时可能有毒。除了水熊，林蛙还能忍受血液和其他组织的冻结。尿素在组织中积累以准备越冬，肝糖原大量转化为葡萄糖以响应内部冰的形成。尿素和葡萄糖都充当“冷冻保护剂”，以限制形成的冰量并减少细胞的渗透收缩。如果不超过65%的全身水结冰，青蛙可以在冬季的许多冻融事件中幸存下来。探索“冻蛙”现象的研究主要由加拿大研究员KennethB..

冷冻耐受性，其中生物通过冷冻固体和停止生命功能来度过冬天，在一些脊椎动物中是已知的：五种青蛙（Ranasylvatica，Pseudacristriseriata，Hylacrucifer，Hylaversicolor，Hylachrysoscelis），一种蝾螈（Salamandrellakeyserlingii），蛇之一（Thamnophissirtalis）和三只乌龟（Chrysemyspicta，Terrapenecarolina，Terrapeneornata）。鳄龟Chelydraserpentina和壁蜥PodarcisMuralis也能在名义上的冰冻中存活，但尚未确定它可以适应越冬。在林蛙的情况下，一种冷冻保存剂是普通的葡萄糖，当青蛙慢慢冷却时，其浓度会增加约19mmol/l。

一位早期的冷冻保存理论家是詹姆斯洛夫洛克。1953年，他提出在冷冻过程中对红细胞的损害是由于渗透应力，并且增加脱水细胞中的盐浓度可能会损害它。在1950年代中期，他对啮齿动物进行冷冻保存实验，确定仓鼠可以在大脑中60%的水结晶成冰而没有不良影响的情况下冷冻；其他器官被证明容易受到损害。

冷冻保存从1954年开始应用于人体材料，其中3次怀孕是由先前冷冻的精子授精引起的。1957年，克里斯托弗·波尔格(ChristopherPolge)领导的英国科学家团队对家禽精子进行了冷冻保存。1963年，PeterMazur，橡树岭国家实验室在美国，证明了如果冷却速度足够慢以允许足够的水在细胞外液逐渐冷冻期间离开细胞，则可以避免致命的细胞内冷冻。该速率在不同大小和水渗透性的细胞之间有所不同：对于许多哺乳动物细胞，在用甘油或二甲基亚砜等冷冻保护剂处理后，典型的冷却速率约为1°C/分钟是合适的，但该速率并不是普遍的最佳值。

冷冻保存过程中对细胞造成损伤的现象主要发生在冷冻阶段，包括溶液效应、细胞外冰形成、脱水和细胞内冰形成。冷冻保护剂可以减少许多这些影响。一旦保存的材料被冻结，它就相对安全，不会受到进一步的损坏。

解决方案效果当冰晶在冰冻的水中生长时，溶质被排除在外，导致它们浓缩在剩余的液态水中。某些溶质的高浓度可能非常有害。细胞外冰的形成当组织缓慢冷却时，水会从细胞中迁移出来，并在细胞外空间形成冰。过多的细胞外冰会因破碎而对细胞膜造成机械损伤。脱水水的迁移导致细胞外冰的形成，也可能导致细胞脱水。电池上的相关应力会直接造成损坏。细胞内冰形成虽然一些生物体和组织可以耐受一些细胞外冰，但任何明显的细胞内冰几乎总是对细胞致命。

防止冷冻保存损坏的主要技术是控制速率和缓慢冷冻的成熟组合以及称为玻璃化的更新的闪速冷冻过程。

可控速率和慢速冷冻，也称为慢速可编程冷冻(SPF)，是一种在几个小时内将细胞冷却到-196°C左右的技术。

慢速可编程冷冻是在1970年代初开发的，并最终在1984年促成了xxx个人类冷冻胚胎的诞生。从那时起，使用可编程序列或受控速率冷冻生物样本的机器已被用于人类、动物和细胞生物学–在将样品冷冻或冷冻保存在液氮中之前，“冷冻”样品以更好地保存它以供最终解冻。这种机器用于世界各地医院、兽医诊所和研究实验室的卵母细胞、皮肤、血液制品、胚胎、精子、干细胞和一般组织保存。例如，“慢速冷冻”冷冻胚胎的活产数量估计约为300,000至400，)出生。

如果在细胞外液逐渐冷冻过程中冷却速度足够慢以允许足够的水离开细胞，则可以避免致命的细胞内冷冻。为了xxx限度地减少细胞外冰晶的生长和重结晶，生物材料（如藻酸盐、聚乙烯醇或壳聚糖）可与传统的小分子冷冻保护剂一起用于阻止冰晶的生长。不同大小和透水性的细胞之间的冷却速率不同：对于许多哺乳动物细胞，在用甘油等冷冻保护剂处理后，典型的冷却速率约为1°C/分钟是合适的或二甲基亚砜，但速率不是一个普遍的最佳值。1°C/分钟的速率可以通过使用诸如速率控制的冷冻机或台式便携式冷冻容器等设备来实现。

几项独立研究提供的证据表明，使用慢速冷冻技术储存的冷冻胚胎在某些方面可能比体外受精中的新鲜胚胎“更好”。研究表明，使用冷冻胚胎和卵子而不是新鲜胚胎和卵子可以降低死产和早产的风险，但具体原因仍在探索中。

研究人员GregFahy和WilliamF.Rall在1980年代中期帮助将玻璃化技术引入生殖冷冻保存。截至2000年，研究人员声称玻璃化冷冻提供了冷冻保存的好处，而不会因冰晶形成而造成损坏。随着组织工程的发展，情况变得更加复杂，因为细胞和生物材料都需要保持无冰状态，以保持高细胞活力和功能、结构的完整性和生物材料的结构。组织工程结构的玻璃化首先由LiliaKuleshova报道，她也是xxx位实现卵母细胞玻璃化的科学家，并于1999年实现了活产。对于临床冷冻保存，玻璃化通常需要在冷却前添加冷冻保护剂。冷冻保护剂是添加到冷冻培养基中的大分子，用于在冷冻和解冻过程中保护细胞免受细胞内冰晶形成的不利影响或溶液的影响。它们在冷冻期间允许更高程度的细胞存活，以降低冰点，以保护细胞膜免受与冷冻相关的伤害。冷冻保护剂具有高溶解度、高浓度低毒性、低分子量以及通过氢键与水相互作用的能力。

糖浆溶液没有结晶，而是变成了无定形的冰——它玻璃化了。非晶态不是通过结晶从液体到固体的相变，而是像“固体液体”，并且转变是在被描述为“玻璃化转变”温度的小温度范围内。

水的玻璃化通过快速冷却来促进，并且可以通过极快的温度下降（每秒兆开尔文）在不使用冷冻保护剂的情况下实现。直到2005年，在纯水中达到玻璃态所需的速率被认为是不可能的。

允许玻璃化通常需要两个条件是粘度增加和冷冻温度降低。许多溶质两者兼而有之，但较大的分子通常具有较大的影响，特别是在粘度方面。快速冷却也促进玻璃化。

对于已建立的冷冻保存方法，溶质必须穿透细胞膜以增加粘度并降低细胞内的冷冻温度。糖不易透过膜。那些有这种作用的溶质，例如二甲基亚砜，一种常见的冷冻保护剂，在高浓度时通常是有毒的。玻璃化冷冻保存的困难妥协之一涉及限制冷冻保护剂本身由于冷冻保护剂毒性而产生的损害。冷冻保护剂的混合物和冰阻滞剂的使用使二十一世纪医药公司能够玻璃化兔子肾脏使用其专有的玻璃化混合物至-135°C。复温后，肾脏成功移植到兔子体内，具有完整的功能和活力，能够无限期地维持兔子作为xxx功能正常的肾脏。2000年，FM-2030成为xxx个在死后被成功玻璃化的人。

通常，对于薄样品和悬浮细胞，冷冻保存更容易，因为它们可以更快地冷却，因此需要较少剂量的有毒冷冻保护剂。因此，冷冻保存人类肝脏和心脏以进行储存和移植仍然不切实际。

然而，冷冻保护剂的适当组合以及升温期间的冷却和冲洗方案通常可以成功地冷冻保存生物材料，特别是细胞悬浮液或薄组织样品。示例包括：

• 精液冷冻保存中的精液
• 血
  • 用于输血的特殊细胞，如血小板（Cellphire的Thrombosomes）
  • 干细胞。它最适合于高浓度合成血清、逐步平衡和缓慢冷却。
  • 脐带血库中的脐带血
• 组织样本，如肿瘤和组织学横截面
• 卵母细胞冷冻保存中的卵子（卵母细胞）
• 处于卵裂期的胚胎（即2、4、8或16个细胞）或处于早期囊胚期的胚胎，处于胚胎冷冻保存中
• 卵巢组织冷冻保存中的卵巢组织
• 出于保护目的，将植物种子或芽尖或休眠芽冷冻保存。

胚胎冷冻保存用于胚胎储存，例如，当体外受精(IVF)产生的胚胎多于当前所需时。

据报道，在三年前同一批次的胚胎成功怀孕后，一个储存了27年的胚胎怀孕并由此健康分娩。许多研究评估了从冷冻胚胎或“霜冻”中出生的孩子。结果一致呈阳性，出生缺陷或发育异常没有增加。一项对11,000多个冷冻保存的人类胚胎的研究表明，储存时间对体外受精或卵母细胞捐赠周期的解冻后存活率或在原核或卵裂阶段冷冻的胚胎没有显着影响。此外，储存时间对临床妊娠、流产、植入或活产率没有任何显着影响，无论是体外受精还是卵母细胞捐赠周期。相反，卵母细胞的年龄、存活率和移植胚胎的数量是妊娠结果的预测因素。

卵巢组织的冷冻保存对于想要将其生殖功能保持在自然极限之外，或者其生殖潜力受到癌症治疗威胁的女性感兴趣，例如在血液系统恶性肿瘤或乳腺癌中。该程序是取一部分卵巢并进行缓慢冷冻，然后在进行治疗时将其储存在液氮中。然后组织可以在输卵管附近解冻并植入，无论是原位（在自然位置）还是异位（在腹壁上），在那里它开始产生新的卵子，从而发生正常的受孕。卵巢组织也可以移植到免疫功能低下的小鼠（SCID小鼠)以避免移植排斥，并且可以在成熟卵泡发育后收获组织。

人类卵母细胞冷冻保存是一项新技术，其中提取、冷冻和储存女性的卵子（卵母细胞）。之后，当她准备好怀孕时，可以将卵子解冻、受精并作为胚胎移植到子宫中。自1999年以来，当Kuleshova及其同事在《人类生殖》杂志上报道了xxx个来自玻璃化加热的女性卵子的胚胎诞生的婴儿时，这一概念已得到认可和广泛传播。实现女性卵母细胞玻璃化的这一突破在我们对IVF过程的知识和实践方面取得了重要进展，因为卵母细胞玻璃化后的临床妊娠率是缓慢冷冻后的四倍。卵母细胞玻璃化冷冻对于年轻肿瘤患者和接受体外受精但出于宗教或伦理原因反对冷冻胚胎实践的个体来说至关重要。