点击化学

在化学合成中，点击化学是一类常用于生物共轭的生物相容性小分子反应，允许将选择的底物与特定的生物分子连接起来。点击化学不是单一的特定反应，而是描述了一种生成遵循自然界示例的产品的方式，它还通过连接小的模块化单元来生成物质。在许多应用中，点击反应将生物分子和报告分子结合在一起。点击化学不限于生物条件：点击反应的概念已用于化学蛋白质组学、药理学和各种仿生应用。然而，它们已在生物分子的检测、定位和鉴定中特别有用。点击反应发生在一个锅中，不受水干扰，产生最少且无害的副产物，并且是弹簧加载的——其特点是高热力学驱动力，可快速且不可逆地驱动它以高产率的单一反应产物，具有高反应特异性（在某些情况下，具有区域特异性和立体特异性）。这些特性使点击反应特别适用于在复杂的生物环境中分离和靶向分子的问题。在这样的环境中，产品因此需要在生理上是稳定的，并且任何副产品都需要是无毒的（对于体内系统）。通过开发特定且可控的生物正交反应，科学家们开辟了在复杂细胞裂解物中击中特定目标的可能性。最近，科学家们已经将点击化学应用于活细胞，例如使用小分子探针，通过点击反应找到并附着在目标上。尽管存在细胞渗透性、生物正交性、背景标记和反应效率方面的挑战，但点击反应已被证明在新一代下拉实验中很有用（其中可以使用例如与特定柱结合的报告分子来分离特定目标）和荧光光谱法（其中荧光团附着在感兴趣的目标上，目标被量化或定位）。最近，新方法已被用于将点击反应配偶体结合到生物分子上和生物分子中，包括将含有反应基团的非天然氨基酸结合到蛋白质中和修饰核苷酸。这些技术代表了化学生物学领域的一部分，其中点击化学通过有意和具体地将模块化单元耦合到各个末端来发挥基本作用。点击化学一词由K.BarrySharpless于1998年创造，并于2001年由斯克里普斯研究所的Sharpless、HartmuthKolb和MGFinn首次全面描述。

点击化学是一种将感兴趣的探针或底物连接到特定生物分子的方法，这一过程称为生物共轭。连接荧光团和其他报告分子的可能性使点击化学成为识别、定位和表征新旧生物分子的非常强大的工具。生物偶联中最早和最重要的方法之一是在与感兴趣的生物分子相同的开放阅读框架上表达报告基因。值得注意的是，GFP最初（现在仍然是）在许多蛋白质的N端或C端以这种方式表达。然而，这种方法有几个困难。例如，GFP是一个非常大的单元，通常会影响感兴趣的蛋白质的折叠。此外，通过在任一末端表达，GFP加合物也可以影响所需蛋白质的靶向和表达。最后，使用这种方法，GFP只能附着在蛋白质上，而不能在翻译后附着，从而使其他重要的生物分子类别（核酸、脂质、碳水化合物等）无法接触。为了克服这些挑战，化学家们选择通过识别成对的生物正交反应伙伴来进行，从而允许使用小的外源分子作为生物分子探针。荧光团可以连接到这些探针之一上，以便在报告分子与靶标结合时发出荧光信号——就像GFP在与靶标一起表达时发出荧光一样。现在限制出现从探针的化学到其目标。为了使该技术在生物系统中有用，点击化学必须在或接近生物条件下运行，产生很少且（理想情况下）无毒的副产物，在相同条件下（xxx）具有单一且稳定的产物，并快速进行一锅高产。现有的反应，如施陶丁格连接和惠斯根1,3-偶极环加成反应，已针对此类反应条件进行了修改和优化。今天，该领域的研究不仅涉及理解和开发新反应以及重新利用和重新理解已知反应，还涉及扩展用于将反应伙伴纳入生命系统的方法、设计新的反应伙伴以及开发生物共轭应用。

对于被视为点击反应的反应，它必须满足某些特征：

• 模块化
• 对溶剂参数不敏感
• 高化学产率
• 对氧气和水不敏感
• 区域特异性和立体特异性
• 大的热力学驱动力（>20kcal/mol）有利于与单一反应产物的反应。明显的放热反应使反应物弹簧加载。

该过程xxx：

• 反应条件简单
• 使用现成的起始材料和试剂
• 不使用溶剂或使用无害或易于去除的溶剂（xxx是水）
• 通过非色谱方法（结晶或蒸馏）提供简单的产品分离
• 具有高原子经济性。

许多点击化学标准是主观的，即使可以就可衡量和客观的标准达成一致，任何反应也不可能对每种情况和应用都是完美的。然而，已经确定了一些比其他反应更符合该概念的反应：

• [3+2]环加成，例如Huisgen1,3-偶极环加成，特别是Cu(I)催化的逐步变体，通常简称为Click反应
• 硫醇-烯反应
• Diels-Alder反应和逆电子需求Diels-Alder反应
• 异腈（异氰化物）和四嗪之间的[4+1]环加成
• 亲核取代，尤其是对像环氧树脂和氮丙啶这样的小应变环
• 由于低热力学驱动力，类似羰基化学的尿素形成但不是醛醇型反应。
• 碳-碳双键的加成反应，如二羟基化或硫醇-炔反应中的炔烃。

经典的点击反应是铜催化的叠氮化物与炔烃形成5元杂原子环的反应：Cu(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)。ArthurMichael在1893年报道了由乙炔二甲酸二乙酯和叠氮化苯合成的xxx个三唑类化合物。后来，在20世纪中叶，这个1,3-偶极环加成家族在他对反应动力学的研究后以Huisgen的名字命名和条件。Huisgen1,3-偶极环加成的铜(I)催化作用是由加利福尼亚州斯克里普斯研究所的ValeryV.Fokin和K.BarrySharpless小组以及丹麦嘉士伯实验室的MortenMeldal小组同时独立发现的.该反应的铜催化形式仅产生1,4-异构体，而Huisgen的非催化1,3-偶极环加成反应产生1,4-和1,5-异构体，速度慢，需要温度为100摄氏度。此外，这种铜催化的“点击”不需要金属上的配体，尽管已经报道了具有各种取代基的加速配体如三（三唑基）甲胺配体并在水溶液中成功使用。也可以使用其他配体，例如PPh3和TBIA，尽管PPh3易于与叠氮化物取代基进行施陶丁格连接。还发现在室温下，水中的Cu2O可在15分钟内以91%的产率催化相同的反应。提出的xxx个反应机理包括一个催化铜原子；但同位素、动力学和其他研究表明，二铜机制可能更相关。尽管该反应在生物条件下有效进行，但该剂量范围内的铜具有细胞毒性。已经提出了解决这个问题的方法，例如在铜上使用水溶性配体以增强催化剂的细胞穿透性，从而减少所需的剂量，或使用螯合配体进一步增加Cu(I)的有效浓度，从而减少实际剂量。尽管Cu(I)催化的变体首先由Meldal及其同事报道，用于在固体载体上合成肽三唑，但他们需要更多时间来发现反应的全部范围，并被公众更认可的Sharpless取代。Meldal和同事也选择不标记这种反应类型的点击化学，据称这导致他们的发现在很大程度上被主流化学学会所忽视。Sharpless和Fokin独立地将其描述为一种可靠的催化过程，为那些依赖于在不同结构单元之间建立共价连接的有机合成努力提供了前所未有的选择性、可靠性和范围。Jia和Fokin小组在2005年报道了由钌而不是铜催化的类似RuAAC反应，并允许选择性生产1,5-异构体。

Bertozzi小组进一步开发了一种Huisgen的无铜点击反应，以克服CuAAC反应的细胞毒性。代替使用Cu(I)来激活炔烃，而是将炔烃引入应变二氟辛炔(DIFO)中，其中吸电子、炔丙基、偕氟与环应变一起极大地破坏炔烃的稳定性。这种不稳定增加了反应驱动力，以及环炔烃减轻其环应变的愿望。该反应以协同的[3+2]环加成反应进行，其机理与Huisgen1,3-偶极环加成反应的机理相同。除了氟之外的取代基，例如苯环，也可以在环辛炔上。该反应已成功用于探测生命系统中的叠氮化物，尽管反应速率比CuAAC慢一些。此外，由于环辛炔的合成通常产率低，因此该反应的探针开发不如其他反应快。但是环辛炔衍生物如DIFO、二苄基环辛炔(DIBO)和联芳氮杂环辛炔(BARAC)都已成功用于SPAAC反应，以探测生命系统中的叠氮化物。

包括二苄基环辛炔(DIBO)在内的二芳基应变环辛炔也已用于在应变促进的炔烃-硝酮环加成(SPANC)中与1,3-硝酮反应，生成N-烷基化异恶唑啉。因为该反应不含金属并且以快速动力学进行（k2快至601/Ms，比CuAAC或SPAAC都快）SPANC可用于活细胞标记。此外，硝酮偶极子以及无环和内环硝酮的碳原子和氮原子上的取代都是可以容忍的。这个大的余量为硝酮手柄或探头的结合提供了很大的灵活性。然而，异恶唑啉产物不如CuAAC和SpAAC的三唑产物稳定，并且可以在生物条件下发生重排。无论如何，这种反应仍然非常有用，因为它具有特别快的反应动力学。该反应的应用包括标记含有丝氨酸作为xxx个残基的蛋白质：丝氨酸用NaIO4氧化为醛，然后用对甲氧基苯硫醇、N-甲基羟胺和对山梨糖苷转化为硝酮，最后与环辛炔孵育以产生咔哒声产品。SPNC还允许多重标记。

应变烯烃还利用应变消除作为驱动力，允许它们参与点击反应。反式环烯烃（通常是环辛烯）和其他应变烯烃（如氧杂降冰片二烯）与许多伙伴（包括叠氮化物、四嗪和四唑）发生点击反应。这些反应伙伴可以与应变烯烃特异性相互作用，与脂质、脂肪酸、辅因子和其他天然产物中的内源烯烃保持生物正交。

氧杂降冰片二烯（或另一种活化烯烃）与叠氮化物反应，生成三唑类产物。然而，这些产物三唑不像在CuAAC或SPAAC反应中那样具有芳香性，因此不稳定。氧杂冰片二烯中的活化双键生成三唑啉中间体，该中间体随后自发地进行逆狄尔斯-阿尔德反应以释放呋喃并生成1,2,3-或1,4,5-三唑。尽管该反应很慢，但它很有用，因为氧杂冰片二烯的合成相对简单。然而，该反应不是完全化学选择性的。

应变的环辛烯和其他活化烯烃与四嗪在逆电子需求Diels-Alder中发生反应，然后进行逆[4+2]环加成（见图）。与反式环辛烯的其他反应一样，环应变释放是该反应的驱动力。因此，三元和四元环烯烃，由于它们的高环应变，是理想的烯烃底物。与其他[4+2]环加成类似，亲二烯体上的给电子取代基和二烯上的吸电子取代基加速了逆需求的狄尔斯-阿尔德。由于具有额外的氮，二烯四嗪是该反应的良好二烯。亲二烯体，即活化的烯烃，通常可以连接到目标分子上的给电子烷基上，从而使亲二烯体更适合反应。

四唑-烯烃“光点击”反应是大约50年前Huisgen首次引入的另一种偶极添加(ChemBioChem2007,8,1504.(68)Clovis,JS;Eckell,A.;Huisgen,R.;Sustmann,R.Chem.Ber.1967,100,60.)具有氨基或苯乙烯基的四唑可以被365nm的紫外线激活（365不会损坏细胞）快速反应（因此紫外线不必长时间打开时间，通常大约1-4分钟）来制备荧光吡唑啉产品。该反应方案非常适合在活细胞中进行标记，因为365nm的紫外光对细胞的损伤最小。此外，反应进行得很快，因此紫外线可以短时间照射。短波长紫外光的量子产率可以高于0.5。这允许四唑在波长上选择性地与另一种光连接反应结合使用，其中在短波长下四唑连接反应几乎完全进行，而在较长波长下另一种反应（通过邻-醌二甲烷连接）仅进行。最后，非荧光反应物产生荧光产物，为反应配备内置的光谱分析手柄。四唑和烯烃基团都已作为非天然氨基酸作为蛋白质手柄掺入，但这种好处并不是xxx的。相反，反应的光诱导性使其成为生命系统时空特异性的主要候选者。挑战包括内源烯烃的存在，尽管通常顺式（如在脂肪酸中）它们仍然可以与活化的四唑反应。

点击化学的商业潜力是巨大的。荧光团罗丹明已与降冰片烯偶联，并在生命系统中与四嗪发生反应。在其他情况下，环辛炔修饰的荧光团和叠氮化物标记的蛋白质之间的SPAAC允许在细胞裂解物中选择这些蛋白质。将点击反应伙伴纳入体内和离体系统的方法有助于扩大可能反应的范围。通过核糖体掺入非天然氨基酸的发展允许将点击反应配偶体作为这些非天然氨基酸上的非天然侧基掺入。例如，具有叠氮侧基的UAA为环炔烃提供了方便地接近带有这种“AHA”非天然氨基酸标记的蛋白质。在另一个实例中，“CpK”具有包括环丙烷α到酰胺键的侧基，其在逆狄尔斯-阿尔德反应中充当四嗪的反应伙伴。萤光素的合成体现了另一种分离反应伙伴的策略，即利用很少出现的天然基团，例如1,2-氨基硫醇，它仅在半胱氨酸是蛋白质中的最终N'氨基酸时出现。因此，它们的天然选择性和相对生物正交性对于开发针对这些标签的特异性探针很有价值。上述反应发生在1,2-氨基硫醇和2-氰基苯并噻唑之间，生成具有荧光的荧光素。然后可以在洗涤后通过光谱法对这种荧光素荧光进行量化，并用于确定带有1,2-氨基硫醇的分子的相对存在。如果需要对含有非1,2-氨基硫醇的蛋白质进行定量，则可以切割感兴趣的蛋白质以产生具有N'Cys的片段，该片段易受2-CBT的影响。

其他应用包括：

• 二维凝胶电泳分离
• 1,4-取代三唑的制备有机合成
• 用三唑修饰肽功能
• 天然产物和药物的改性
• 天然产物发现
• 药物发现
• 使用Cu(I)催化的三唑偶联进行大环化
• 通过三唑连接修饰DNA和核苷酸
• 超分子化学：杯芳烃、轮烷和链烷
• 树枝状大分子设计
• Cu(1)催化的三唑连接反应的碳水化合物簇和碳水化合物共轭
• 聚合物和生物聚合物
• 表面
• 材料科学
• 纳米技术，
• 生物偶联，例如叠氮香豆素，和
• 生物材料

结合组合化学、高通量筛选和建立化学文库，点击化学通过使多步合成中的每个反应快速、高效和可预测，加快了新药的发现。

斯克里普斯研究所拥有一系列点击化学专利。被许可方包括Invitrogen、Allozyne、Aileron、IntegratedDiagnostics和生物技术公司baseclick，这是一家巴斯夫的衍生公司，旨在销售使用点击化学制造的产品。此外，baseclick拥有全球核酸领域研究和诊断市场的独家许可。ActiveMotifChromeon和Cyandye等公司也生产荧光叠氮化物和炔烃。